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逆转录酶从入门到精通


什么是逆转录酶?OR 什么是反转录酶?


逆转录酶,英文名是Reverse Transcriptase,又称反转录酶,RT酶。逆转录酶是RNA指导的DNA聚合酶。反转录酶以RNA为模板,以dNTP为底物,tRNA( 主要是色氨酸tRNA) 为引物,在tRNA 3'-OH 末端上,根据碱基配对的原则,按5'-3'方向合成一条与RNA 模板互补的单链DNA ,这条DNA 单链叫做互补DNA (complementary DNA,cDNA)。含有逆转录酶的病毒叫做反转录病毒,逆转录酶催化的反应叫反转录(reverse transcription)。在这个过程中,遗传信息流动的方向是从RNA到DNA,正好与转录过程相反,故称反转录。


RT酶、反转录酶、逆转录酶晶体结构,美格生物

图1. 野生型HIV-1逆转录酶晶体结构. 根据PDB: 3KLF绘制


逆转录酶的历史

逆转录酶是怎样被发现的?

1970年,美国科学家特明(H.M.Temin)和巴尔的摩(D.Baltimore)两人各自都从酵素中发现反转录的反应,将此命名为逆转录酶, RT酶。逆转录酶首先是由霍华德·马丁·特明在劳氏肉瘤病毒中发现的,同年,由·巴尔的摩独立从两种RNA肿瘤病毒:R-MLV以及在劳氏肉瘤病毒中分离出来。由于这些发现RT酶的成就,两人在1975年共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。

逆转录病毒是怎样工作的呢?

逆转录的原理

科学家经过研究,发现了反转录的原理:当RNA致癌病毒,如鸟类劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)进入宿主细胞后,其逆转录酶先催化合成与病毒RNA互补的DNA单链,继而复制出双螺旋DNA,并经另一种病毒酶的作用整合到宿主的染色体DNA中,这个整合的DNA可能会潜伏数代,不表达,等到适合的条件时被激活,再利用宿主的酶系统转录成相应的RNA,其中一部分作为病毒的遗传物质,另一部分则作为mRNA翻译成病毒特有的蛋白质。最后,RNA和蛋白质被组装成新的病毒粒子。在一定的条件下,整合的DNA也可使细胞转化成癌细胞。

后来发现,逆转录酶不仅存在于某些RNA病毒,也存在于哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞。

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反转录酶有哪些活性?


逆转录酶具有三种酶活性

  1. 以RNA为模板指导的DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物,多为色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高 。

  2. 以DNA为模板指导的DNA聚合酶活性;DNA指导的DNA聚合酶活性;以反转录合成的第一条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子。

  3. RNase H活性。由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNase H从RNA 5′端水解掉RNA分子。

逆转录酶的种类

自然界有许多逆转录酶,目前人们研究比较多的逆转录酶包括:

  1. 人类免疫缺陷病毒1型HIV-1逆转录酶(PDB:1HMV), 有两个亚基,分别具有66和51kDa的分子量。人类免疫缺陷病毒又称艾滋病病毒。

  2. 来自莫洛尼鼠白血病病毒的M-MLV逆转录酶,是单个75kDa的单体。

  3. 来自禽成髓细胞瘤病毒的AMV逆转录酶,具有两个亚基,63kDa亚基和95kDa亚基。

  4. 端粒酶逆转录酶,维持真核染色体的端粒。


在病毒中反转录酶的作用

病毒将逆转录作为复制过程中的一个步骤,编码和使用反转录酶。进行反转录的RNA病毒,如逆转录病毒,利用这种酶将其RNA基因组反转录成DNA,然后DNA被整合到宿主基因组中,并与宿主基因组一起复制。

进行反转录的DNA病毒,如肝炎病毒,可以让RNA作为模板组装和制造DNA链。HIV病毒通过反转录酶感染人类。如果没有逆转录酶,病毒基因组将无法整合到宿主细胞中,导致复制失败。


逆转录过程或反转录的过程

在逆转录酶缺乏DNA依赖性DNA聚合酶活性的病毒物种中,双链DNA的产生可能由宿主编码的DNA聚合酶δ完成,误将病毒DNA-RNA当作引物,并通过与去除引物相似的机制合成双链DNA,新合成的DNA取代了原来的RNA模板。

反转录的过程,也被称为逆转录或逆转录,是极易出错的,正是在这一步,突变可能发生。这种突变可能导致耐药性。


逆转录病毒如何逆转录?

逆转录病毒,也被称为6型ssRNA-RT逆转录病毒,是带有DNA中间体的RNA逆转录病毒。它们的基因组由两个带有5'帽和3'多聚腺苷酸化尾的正义单链RNA分子组成。

逆转录病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒HIV人类嗜T淋巴细胞病毒HTLV。双链DNA的产生在细胞质基质中发生,这包括以下一系列的步骤:

1. 赖氨酸tRNA,Lysyl tRNA ,作为引物,与病毒RNA基因组的互补部分(称为引物结合位点或PBS)杂交。

2. 逆转录酶将DNA核苷酸加到引物的3'端,合成与病毒RNA的U5区(非编码区)和R区(RNA分子两端的直接重复)互补的DNA。

3. 逆转录酶上的一个称为RNAse H的结构域降解RNA 5'端的U5和R区域。

4. 然后tRNA引物“跳”到病毒基因组的3'端,新合成的DNA链与RNA上的互补R区杂交。

5. 在步骤2加入的互补DNA, cDNA, 进一步扩展。

6. 大多数病毒RNA被RNAse H降解,只剩下PP序列。

7. 使用病毒RNA的剩余PP片段作为引物, 第二条DNA链的合成开始。

8. tRNA引物离开,一个“跳跃”发生。来自第二链的PBS与第一链上的互补PBS杂交。

9. 两条链都被延伸,形成一个原始病毒RNA基因组的双链DNA的完整拷贝,然后通过整合酶将其整合到宿主基因组中。

逆转录/反转录在HIV中的作用机制,美格生物

图3. 逆转录在HIV中的作用机制.


双链DNA的产生还涉及到链转移,在链转移中,将来自最初的RNA依赖性DNA合成的短DNA产物转移到基因组另一端的受体模板区域,随后它的DNA依赖性DNA活性被逆转录酶处理。


逆转录病毒RNA从5'端到3'端排列。在引物结合位点PBS,引物退火,构建病毒RNA。

PBS位点的RNA 5'端称为U5,PBS的RNA 3'端称为前导。tRNA引物在14到22个核苷酸之间展开,并在PBS处与病毒RNA形成碱基配对双链。

事实上,PBS位于病毒RNA的5'末端附近是不寻常的,因为逆转录酶从引物的3'端开始,按5'端到3'端方向,合成DNA(相对于新合成的DNA链)。因此,引物和逆转录酶必须重新定位到病毒RNA的3'端。为了完成这种重新定位,需要多个步骤和多种酶,包括DNA聚合酶、核糖核酸酶RNase H和多核苷酸解旋。


HIV逆转录酶还具有核糖核酸酶活性,可在cDNA合成过程中降解病毒RNA,以及DNA依赖性DNA聚合酶活性,该活性可将正义cDNA链复制到反义DNA中,形成双链病毒DNA中间体(vDNA)。

在细胞生命中真核基因组的自我复制扩展区段,称为逆转座子,利用逆转录酶,通过RNA中间体,从基因组中的一个位置移动到另一个位置。

它们在植物和动物的基因组中被大量发现。端粒酶是在包括人在内的许多真核生物中发现的另一种逆转录酶,其携带其自身的RNA模板;该RNA用作复制DNA的模板。


早在1971年,法国的Beljanski等人最早报告了原核生物中的逆转录酶,几年后,苏联的Romashchenko也对逆转录酶进行了报告。从那以后,这些被广泛地描述为细菌逆转子的一部分,不同的序列编码逆转录酶,并用于合成msDNA。为了启动DNA的合成,需要一个引物。在细菌中,引物是在复制过程中合成的。俄勒冈州的Valerian Dolja认为,因其多样性,病毒在细胞生命的发展中起着进化作用,逆转录酶起着核心作用 。

逆转录酶/反转录酶(RT酶)的晶体结构

逆转录酶/反转录酶的手指结构,美格生物

逆转录酶采用类似人的“右手”的结构,类似于在其他病毒核酸聚合酶中发现的结构。除了转录功能外,逆转录酶还具有属于RNase H家族的结构域,这对它们的复制至关重要。通过降解RNA模板,它可以合成另一条DNA链。一些来自消化的片段也可以作为DNA聚合酶(同一种酶或宿主蛋白)的引物,负责制造另外(增加的)链。   

复制的保真度

在逆转录病毒的生命周期中有三种不同的复制过程。

首先,逆转录酶从病毒RNA合成病毒DNA,然后从新形成的互补DNA链合成病毒DNA。

第二个复制过程发生在宿主细胞DNA聚合酶复制整合的病毒DNA时。

最后,RNA聚合酶II将前病毒DNA转录成RNA,RNA将被包装成病毒粒子。

因此,这些复制步骤中的每一个或所有步骤都可能发生突变。


逆转录酶在将RNA转录到DNA中时有很高的错误率,因为它不像大多数其他DNA聚合酶,它没有校对能力。相对于校对形式的复制,这种高错误率使得突变以加速度累积。根据Promega公司生产的商用逆转录酶手册,其AMV酶的错误率在1/17000碱基,M-MLV酶的出错率是的1/30000碱基。除了产生单核苷酸多态性外,逆转录酶还参与转录融合、外显子改组和产生人工反义转录物等过程。据推测,逆转录酶的这种模板转换活性,这种活性在体内完全被证实,可能是在模式生物基因组中发现数千个未注释转录物的原因之一。

两个RNA基因组被包装到每个逆转录病毒质粒中,但在感染后,每个病毒只产生一个前病毒。感染后,逆转录伴随着两个基因组拷贝之间的模板转换(拷贝选择重组)。有两种模型可以解释为什么RNA转录酶会转换模板。

第一种是强制拷贝选择模型,它认为逆转录酶在遇到缺口时会改变RNA模板,这意味着重组是维持病毒基因组完整性的必由之路。

第二个是动态选择模型,表明当RNAse功能和聚合酶功能在速率上不同步时,逆转录酶改变模板,这意味着重组是随机发生的,而不是对基因组损伤的反应。

Rawson等人的一项研究支持这两种重组模型。每个基因组在每个复制周期发生5到14个重组事件。模板转换(重组)似乎是维持基因组完整性和挽救受损基因组的修复机制所必需的。


逆转录酶应用

抗病毒药

由于艾滋病毒利用逆转录酶复制其遗传物质并产生新的病毒(逆转录病毒增殖循环的一部分),因此设计了特定的药物来破坏这一过程,从而抑制其生长。这些药物统称为逆转录酶抑制剂,包括核苷和核苷酸类似物齐多夫定(Retrovir)、拉米夫定(Epivir)和替诺福韦(Viread),以及非核苷抑制剂,如奈韦拉平(Viramune)。

分子生物学应用

逆转录酶常用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),一种将聚合酶链反应应用于RNA的技术。经典的PCR技术只能应用于DNA链,但在逆转录酶的帮助下,RNA可以被转录成DNA,从而使RNA分子的PCR分析成为可能。

逆转录酶也用于从mRNA中创建cDNA文库。逆转录酶的商业化应用极大地提高了分子生物学领域的知识,因为它与其他酶一起,使科学家能够克隆、排序和表征RNA。

逆转录酶也被用于胰岛素产品。通过在细菌中插入用于胰岛素产品的真核mRNA和逆转录酶,可以将mRNA插入到原核生物的基因组中。大量的胰岛素可以被制造出来,绕开了提取猪胰腺和其他传统的方法。

直接将真核细胞DNA插入细菌是行不通的,因为它携带内含子,所以不能利用细菌核糖体进行成功的翻译。在真核细胞mRNA产生过程中,处理过程去除了这些内含子,以提供合适的模板。逆转录酶将这个经过编辑的RNA转换回DNA,这样它就可以被整合到基因组中。


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