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第二代SHERLOCK检测技术:SHERLOCK V2

作者:Magigen

SHERLOCK检测技术在2017年首次推出时有一些局限性,第一代SHERLOCK系统的主要缺点在于它是定性的,而不是定量的。为了提高检测灵敏度,张锋团队对第一代SHERLOCK系统进行升级,以改进其检测性能。

他们发现cas13变体的一个子集靶向相互排斥的序列。通过使用四种这样的cas13蛋白质, 并为每种蛋白质设计特定的报道基因,创建了SHERLOCKv2系统,该系统一次可以检测多达四种病毒。

研究人员还发现,Cas13切割产物可激活另一种cas蛋白Csm6。第二个单链RNA结构可以通过激活的csm6来切割,增强了相对于背景的信号, 改善了sherlockv2反应的动力学。

为了提高灵敏度,SHERLOCK V2同样采用了等温扩增技术,可以检测到浓度低至每毫升样本两拷贝的病毒DNA序列。和DETECTR的区别在于SHERLOCKV2设计的荧光报告基因必须是特异性,而DETECTR则是非特异性的。然而,也正是“特异性”这个优点使得sherlock v2 可以在同一样品中同时检测出多种病毒感染,比如要同时检测出流感病毒和登革热病毒,只需要在系统加入不同细菌、不同的Cas13酶。这些不同的 cas13蛋白 酶对不同的RNA序列表现出不同的“偏爱”程度。同时向细胞递送多种酶和多种不同荧光报告分子基团,一旦 CRISPR 系统发现目的基因,对应的Cas13就会启动剪切酶活性,剪切相应的荧光报告分子,从而释放出荧光信号。

相比于SHERLOCK v1, SHERLOCK V2有哪些改进?

1.    SHERLOCKv2在预扩增步骤中使用的引物要少得多,从而在不影响灵敏度的情况下实现更高的定量。

2.    为了在一个反应中检测多个靶点,Cas酶(如Cas13和Cas12a的变异体)与每个酶的不同荧光报告物结合。

3.    此外,csm6是一种CRISPRⅢ型效应核酸酶,可与Cas13结合用于放大单个靶点的信号。Csm6可以切割与相关的crRNA互补的ssRNA,并且可以方便地被Cas13-ssRNA切割副产物激活。因此,Cas13与所编程的相关区域的结合将导致Cas13特异性报告子的裂解和Csm6的激活。通过添加Csm6和Csm6特异报告子(与Cas13报告子在同一个荧光通道中),他们可以显著放大单个目标的检测信号。

4.    SHERLOCKv2经过改造,可以在商业侧流试纸条上检测到被剪切的报告分子,类似于妊娠试验。想要从给定样本中发现是否有要找的DNA或RNA,仅需在横向流动试纸条设置好几个检测条带,将一滴样品滴加到诊断试纸条上,进行确定。这种类型的读取方法允许几乎任何地方的核酸检测,因为横向流动条易于运输和快速工作,在短短一小时内就可以提供可靠的结果。SHERLOCKv2优于SHERLOCK,因为整个SHERLOCKv2反应在一个步骤中完成,只需将生物样品直接应用于测试条即可,无需纯化和分离核酸。这种方式不需要仪器,成本低,使用方便。


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