TEL   :020-34438810     18027152056
Email:  info@magigen.com

领先的CRISPR CAS蛋白、IVD分子检测技术、原料酶提供商


美格生物
MAGIGEN

CRISPR Cas13结合光刻机技术, 实现快速病毒检测

作者:Magigen来源:Nature

applificationfree5a.jpg

图1.


上一篇文章提到Rikiya Watanabe团队设计了一种基于CRISPR的无需扩增RNA检测的SATORI方法。

想阅读上篇文章?请点击:无需扩增的CRISPR Cas13 RNA病毒检测技术


SATORI是怎么构建的呢?

Rikiya Watanabe团队的构想非常巧妙。SATORI采用了光刻技术,制作了精密的微腔阵列器件,达到了分子检测的标准。


利用光刻技术制作微腔阵列器件

采用常规光刻技术在薄玻璃基片上制备疏水性通孔结构。

用32 毫米 × 24 毫米盖玻片孵育过夜,然后在8 N KOH溶液中,用超声处理1小时,用纯水冲洗,并用吹风枪干燥。

在这个玻璃上,全氟聚合物(9%的CYTOP,AGC)以每分钟1000rpm或者4000rpm的转速,旋转涂膜30秒、 然后在80°C烘烤10 分钟,180 °C烘烤1小时。

CYTOP层厚度为1.6μm或0.6 μm,用激光显微镜(VK-X1100,Keyence)测定。

正性光刻胶(AZ P4620,AZ电子材料公司)在CYTOP层上,以每分钟7500rpm的转速,旋转涂膜30秒、 然后在100°C,处理5 分钟。

在25℃、60%的湿度条件下,将光刻胶再水化5分钟之后,使用光刻机(PEM-800,Union,图2)和1μm孔的铬光掩模,将玻璃暴露在UV光下,然后用显影剂(AZ300 MIF,AZ电子材料)造影1.5 分钟。美格君发现,Rikiya Watanabe团队用来开发产品的这款光刻机居然是2004年的“老”产品,令人敬佩。

CRISPR Cas13结合光刻机技术, 实现快速病毒检测CRISPR Cas13结合光刻机技术, 实现快速病毒检测

图2. 这是2004年产的PEM-800光刻机


用干法刻蚀机(DES-101E,YAC)和O2 plasma 除去裸露者光刻胶的CYTOP。

通过用丙酮acetone,异丙醇和纯水连续冲洗,除去剩余的光刻胶,完成微室装置的制造。用上述激光显微镜评估装置的质量。

选择孔径为2.5±0.2μm的器件,用于我们的实验。

通过将U形框架腔室密封件(SLF0601,Bio-Rad)和带有入口端口(Tsubaki glass Kogyosyo)的定制玻璃块连接在装置上,构建流动池。


CRISPR Cas蛋白制备

用pET-LwaCas13a蛋白质粒转化大肠杆菌Rosetta 2(DE3,可以利用Magigen LwCas13a蛋白),在37 °C、100 mL TB培养基中,添加氯霉素和卡那霉素,进行培养。

当OD600达到0.6-0.8时,细菌培养物在冰上冷却10 分钟,然后在20 °C,和0.mMIPTG, 继续培养20小时。

收集大肠杆菌细胞,悬浮于5 mL缓冲液A(20nM盐酸三辛酯Tris-HCl (pH 8.0),1 M NaCl和20 mM咪唑),并用超声仪(Q500,QSONICA)破碎。

在15000rpm转速离心15分钟后,将上清液加载到用缓冲液A平衡的Ni-Sepharose High Performance column (GE Healthcare)上。

蛋白用用缓冲液B(20 盐酸三辛酯(pH 8.0),300 mM NaCl,and 400 咪唑)洗脱 。

将该蛋白载入 HiTrap Heparin HP column (1 mL; GE Healthcare),用缓冲液C(20 盐酸三辛酯(pH 8.0)及300 mM NaCl)平衡。

蛋白质以0.3-2M线性改变的NaCl洗脱。通过SDS-PAGE分析级分,并合并峰级分。

根据通过NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)测量的A280值,测定蛋白质浓度。将纯化的CRISPR LwaCas13a蛋白的等分试样在液氮中快速冷冻,并储存在−80 °C,直到测量。

RNA制备

使用部分双链DNA模板(补充表4),在37℃,用1小时,在体外,用T7 RNA聚合酶转录crRNA或tgRNA(补充表1和2) 。

为了去除双链RNA污染,如前所述,转录的RNA与RNaseIII(New England Biolabs)在37℃温育 30 分钟,然后通过8%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

RNA浓度由NanoDrop分光光度计测量的A260值确定。


SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-027)在VeroE6/TMPRSS2细胞(JCRB 1819)中生长,该细胞维持在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Sigma-Aldrich)中。

含有5%胎牛血清(FCS)和1%青霉素/链霉素。使用RNeasy Mini kit(Qiagen)提取SARS-CoV-2的全基因组RNA,并储存在−80 °C直到使用。


SATORI配置

用缓冲区液D(20 mM HEPES(pH 7.5),150 nM KCl,10 nM MgCl2和0.5mM DTT),将纯化的CRISPR LwaCas13a蛋白稀释至1 μM。

CRISPR LwaCas13a(1 μM) 与等体积的crRNA(625 nM)在无核酸酶的水中混合,然后在37℃下孵育 10分钟。

然后将CRISPR LwaCas13a crRNA复合物(4 μL) 加入到实验混合物中(46 μL) :缓冲区液D,其中包含10 μM FQ reporter(Integrated DNA Technologies,Supplementary Table 3),

500 μM Triton X-100(Nacalai Tesque),20 μM Alexa Fluor公司™ 647 C2 Maleimide(Thermo Scientific)和各种量的tgRNA。

混合物(50 μL) 从玻璃块上的入口端口装载到微室装置上,然后在25℃下孵育 几分钟。该装置设置在共聚焦显微镜(A1,尼康)的电动XY扫描台上,

配备了60× 油浸镜头(NA = 1.40, Apo, Lambda S)及488及640 nm激光器。为了测定SARS-CoV-2的全基因组RNA,将该装置设置在宽视野显微镜(IX71,Olympus)的电动XY扫描台上,

配备20× 干镜头(NA = 0.45)及488及640 nm激光器。然后,使用定制的电移液器(ICOMES),以4 μL/s的速度,将40 μL十六烷hexadecane(296317,Sigma-Aldrich)加载到设备里。

加载后50秒,开始40个阶段位置的荧光平铺成像开始,成像温度是25 °C。


为了检测污染对SATORI的影响,在测试混合液中添加 PBS(10%),病毒转运培养基VTM(70%,SGI)和标准RNA(3 ng/μL、 Qubit RNA BR Standard #2, Thermo Scientific),并进行SATORI测定。

VTM由细胞培养基,牛血清白蛋白,青霉素,链霉素,庆大霉素和两性霉素B组成。对于具有70%VTM的测定,从测定混合物中除去KCl。


为了分析唾液,将10%的唾液在20mM HEPES(pH7.5)的溶液中稀释 ,溶液含10mM MgCl2,20U核糖核酸酶RNase抑制剂(AM2694,Thermo Scientific),

100 mM DTT和1 mM Triton-X100,在金属浴(MyBL-10,AS ONE亚速旺)上加热, 90 °C, 5分钟。 不同量的tgRNA,5μM FQ报告子,

20μM Alexa Fluor™   647 C2 Maleimide和LwaCas13a crRNA复合物添加到溶液中,并且如上所述进行SATORI测试。


检测样品制备

鼻咽拭子、前鼻拭子和咽喉拭子样本是根据疾病控制和预防中心CDC的方案收集的。

鼻咽拭子和咽拭子样本 在1mL缓冲液D中制备,缓冲液D含100nMDTT和1nM Triton X-100。

对于前鼻拭子样品的分析,从缓冲液D中去除KCl。在90°C加热后 5分钟后,20U 核糖核酸酶RNase抑制剂,tgRNA,10μM FQ报告子,20μM Alexa Fluor™ 647 C2 Maleimide,

CRISPR LwaCas13a–crRNA复合物添加到样品中,并进行SATORI分析.


对于复合SATORI分析,CRISPR LwaCas13a蛋白(4 μM) 与等量的2.5μM crRNA(crRNA-CoV-N-1、-4或-7)混合,

然后在37℃培养 10分钟。 每个LwaCas13acrRNA复合物(1μL) 加入分析混合物(47μL)中,然后 进行SATORI分析。


反式裂解活性的动力学测定

为了在单分子水平上测量CRISPR LwaCas13a的反式裂解活性,在将十六烷加载到微室装置上后立即开始成像。

每3秒间隔记录单个阶段点的荧光图像 。使用平均荧光强度与FAM浓度的校准曲线,基于每个室中的平均荧光强度,计算切割FQ报告器的数量,并通过激光显微镜(Keyence)测量微腔体积。

为了获得校准曲线,在缓冲液D中加入不含任何猝灭剂的荧光素结合ssRNA(56-FAM/rUrUrUrUrU, Integrated DNA Technology) ,

溶液包含500μM Triton X-100和20μM Alexa Fluor 647,装入微室装置,然后用十六烷密封,并使用与SATORI分析相同的设置进行成像。


在测试缓冲液(20 mM HEPES(pH 6.8),60 mM NaCl,and 6 毫米MgCl 2)中,加入LwaCas13a(45 nM),crRNA(22.5) nM),FQ报告子(125 nM),鼠核糖核酸酶RNase抑制剂(0.5 μL、NEB),

以及不同数量的tgRNA,测试批量反式切割。反应在37°c孵育10 分钟,用荧光酶标仪(SpectraMax ID3,Molecular Devices),每1分钟检测一次荧光,激发波长470 nm,发射波长520 nm。


CRISPR Cas13结合光刻机技术, 实现快速病毒检测

图3.

数据分析

使用ImageJ/Fiji进行图像处理,包括球差校正,漂移校正,背景扣除和腔室中荧光强度的提取。

ImageJ plugin, Template Matching and Slice Alignment用于漂移校正。

所有的过程都是使用宏程序自动化处理。使用Python和Anaconda3编写程序,分析一系列提取的强度数据.

LOD值定义如下:

用不同浓度的tgRNA获得的输出值被拟合成一条线性曲线(输出值分别对应于SATORI的阳性微腔数和基于荧光读板方法的荧光强度)。

平均值+3 S.D.,做为不含tgRNA的输出值。

确定线性曲线与输出值(平均值+3 S.D.)交汇点的值。

该交汇点的浓度就是LOD。


复合SATORI的理论LOD值

根据单分子测量方式,LOD值被确定为拟合线性回归线和背景平均值的交叉点 + 3 S.D.值,点B(图1g和3c)。阳性微腔数N表示为LOD的函数。

CRISPR Cas13结合光刻机技术, 实现快速病毒检测


结合靶RNA后,LwaCas13a–crRNA复合物将顺式或反式切割RNA靶标成多个RNA片段。

因此,在含有三种不同cRNAs的LwaCas13a存在的情况下,三种LwaCas13a–cRNA–tgRNA分子由单个靶标RNA分子产生。

因此,具有三个crRNA组合的复和SATORI的理论Nmp为NN1、NN4和NN7之和,如下所示:

CRISPR Cas13结合光刻机技术, 实现快速病毒检测

其中,LODN1、LODN4、LODN7和LODmp分别是N-1、-4、-7及其组合的LOD值。通过比较系数,LODmp作为LODN1、LODN4和LODN7的函数给出如下。

CRISPR Cas13结合光刻机技术, 实现快速病毒检测

根据式(3),理论LODmp计算为4.0 ± 1 fM,与实验结果相吻合, 5.7± 2.2 fM(图3c,d)。


统计和可重复性

本文描述的所有测量都是从不同的样本中进行的,所有在纸上进行的实验都成功地重复了三次以上。


参考文献

Amplification-free RNA detection with CRISPR–Cas13

Author: Hajime Shinoda et al


相关阅读

无需扩增的CRISPR Cas13 RNA病毒检测技术

什么是SHERLOCK技术?

用CRISPR Cas13a编辑RNA   

基于CRISPR Cas13a的快速、简易核酸检测CREST

CRISPR Cas13a结合恒温扩增技术进行病毒检测与实战验证

如何设置CRISPR Cas13a与恒温扩增检测反应体系   

脑洞大开,用CRISPR CAS13A喷雾治疗流感和新冠病毒   

从CRISPR Cas13开始: Crispr Cas13蛋白的作用与用途   

用Cas13进行大规模多重核酸检测   

Cas13诱导细胞休眠,以阻止抗Crispr噬菌体的生长

RNA targeting with CRISPR Cas13a





会员登录
登录
我的资料
我的收藏
留言
回到顶部