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美格生物
MAGIGEN

恒温扩增技术系列之环介导LAMP扩增技术

作者:Magigen

美格生物最近推出的恒温扩增技术产品LAMP试剂盒 2×LAMP Amplification Mix ‍ ‍‍是全新一代LAMP扩增技术产品。



什么是LAMP扩增技术?

LAMP恒温扩增技术的英文名称是:Loop-mediated isothermal amplification, LAMP, 中文名称是:环介导等温扩增反应。


LAMP技术的历史

LAMP技术是日本学者Notomi在2000年发明的,他利用特殊的引物设计方法和恒温核酸链置换酶,可以在60分钟内,将少量目标DNA 扩增到千百万份。目前该技术应用已经有超过20年的历史。


等温扩增LAMP技术扩增原理图

图1.   LAMP扩增反应原理图



环介导等温核酸扩增反应LAMP扩增原理

LAMP技术是一种新型的核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6-8个区域设计4-6种特异引物,进行高度特异性扩增反应。在链置换酶Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下,与特殊设计的引物形成“环”结构,在60~65℃进行恒温扩增,大约15-60分钟就可实现109~1010倍的核酸扩增,具有操作简单。在DNA合成的时候,从脱氧核糖核酸三磷酸底物dNTP中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应,产生了大量的焦磷酸镁沉淀,呈现白色,可以把浑浊度作为反应的指标,只依靠肉眼观察白色浑浊沉淀,就可以鉴定是否有扩增,不需要繁琐的电泳和紫外观察。

LAMP引物设计和反应原理如图1所,在每一套LAMP的引物中,包括两个外部引物:F3和B3,两个内部引物:FIP和BIP,以及两个环导引物:LOOP F和LOOP B。

LAMP反应混合物由dNTPs、引物、DNA模板、链置换聚合酶Bst酶和荧光染料。用于LAMP反应的引物设计比较特别。向前内引物FIP由3' 末端的F2区和5' 末端的F1c区组成;F3引物是正向外引物,由F3区组成,与模板序列的F3c区互补;向后内部引物BIP由3' 末端的B2区域和5' 末端的B1c区域构成。向后外引物-B3引物-由B3区组成,与模板序列的B3c区互补。当FIP的F2区与靶DNA的F2c区杂交,并启动互补链合成时,开始扩增,然后F3引物与靶DNA的F3c区域杂交,并延伸,取代FIP连接的互补链。该置换链在5' 末端形成环LOOP,这种在5' 末端具有环的单链DNA用作BIP的模板,B2与模板DNA的B2c区域杂交,启动DNA合成,形成互补链、并打开5' -末端环,随后,B3与靶DNA的B3c区域杂交并延伸,置换BIP连接的互补链,这导致形成哑铃形DNA。通过Bst DNA聚合酶将核苷酸添加到F1的3' 末端,其在5' 末端延伸并打开环,哑铃形DNA现在转变为茎环结构。该结构用作LAMP循环的引发剂,它是LAMP反应的第二阶段。也可以添加环引物用于LAMP的指数扩增,获得的最终产品是具有不同茎长度的茎环DNA和具有多个环的各种类似于菜花的结构的混合物。

LAMP反应温度一般在65°C,扩增程度小于250nt。DNA产物非常长,大于20KB,由80–250bp的短目标序列多次重复形成,与长链共聚体中的单链环区相连。这些产品通常不适合下游操作,但目标扩增非常的多,因此有可能有多种检测模式。采用插层或探针、横向流动和琼脂糖凝胶检测等方法的实时荧光检测均与LAMP反应直接兼容。LAMP设备通常需要加热到所需反应温度,并在需要时实时荧光进行定量测量。



LAMP扩增产物的检测方法

目前,应用比较广泛的LAMP检测方法主要有以下几种:

  • 横向侧流技术:利用横向侧流试纸条进行检测;

  • 荧光检测: 在LAMP反应液中加入 SYBRGreenΙ ,可以在紫外灯下通过肉眼判定;

  • 目测或浊度检测: 通过对扩增过程中产生的副产物-焦磷酸镁沉淀-来检测判断有无扩增产物;

  • 凝胶电泳检测:由 于扩增后的产物是一系列反向重复的靶序列构成的,是茎环结构和多环花椰菜结构的DNA片段混合物, 电泳后在凝胶上显示不同大小区带的阶梯式图谱。



LAMP技术的优点

  • 特异性高。针对靶序列的6个区域设计4种特异性引 物,6个区域中如有一处与引物不匹配,就不能进行核酸扩增。

  • 灵敏度高。对某些病原体进行扩增, 模板只要几个拷贝数, 与PCR相比高出几个数量级。

  • 高效、快速。不需要预先的双链DNA的热变性, 反应时间短,30~60分钟就能完成反应,避免了温度循环造成的时间损失。

  • 操作简单。 LAMP扩增反应只需要一个简单的恒温器, 水浴锅、金属 浴均可完成此实验,不需要昂贵的仪器, 可方便操作。

  • 检测LAMP产物方便。 LAMP 在合成 DNA 的过程中会产生大量的焦磷酸根离子, 能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀, 因此可以根据反应体系中是否生成白 色沉淀来判断反应的进行情况。



环介导等温扩增LAMP方法的缺点与局限


  • 容易假阳性。LAMP扩增技术灵敏度高,一旦开盖就容易形成气溶胶污染,目前国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题比较严重。大量研究推荐使用浊度计等不开盖方法检测扩增产物。 但这些措施并不能在根本上解决假阳性率高的问题,还会存在非特异性扩增。 此类非特异扩增产物的出现与引物序列性质、反应时间的长短有关系, 通过引 物筛选、反应时间优化能很大程度上降低其产生几率, 但这会影响LAMP技术的可靠性, 限制其在临床的推广。

  • LAMP引物设计难度较大。LAMP引物设计要求比较高,对靶序列和引物的长度有很高要求以确保特异性扩增,有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法;

  • 反应结果只有扩增和不扩增两种, 一旦出现非特异性的扩增, 则不易鉴别。

  • 很难做多重扩增,两三个靶点可以,再多难度就非常大了。

  • 在敏感性上、定量能力上、封闭系统等方面LAMP反应不如实时PCR。


LAMP扩增反应的实际应用

由于环介导等温扩增技术LAMP扩增技术使用简便、成本低、灵敏度高,该技术目前已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测,以及各种细菌、病毒、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口现场快速诊断中。


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