如何改造Taq酶？

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌Thermus aquaticus YT1株分离提取的。YT是一种嗜热真菌，能在70～75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.

Taq DNA聚合酶的改造

Taq DNA聚合酶发现了几十年，在分子生物学领域具有广泛的应用。研究人员对其不断的进化与改造。通过结构域重组、定点突变、定向进化等技术，Taq DNA聚合酶突变体的许多催化性能得到很大改善，并拥有了新的功能，Taq酶的应用范围也不断扩大。

常用的Taq酶改造方法有

• 定点突变

• 定向进化

• 结构域重组

1. 通过理性设计得到的突变体

    1.1   缺失突变体。

           Taq DNA聚合酶的**个突变体就是N端删除大片段了，根据删除长度的差异，有不同的名称：KlenTaq(∆236)（Barnes, 1992），Klentaq1(∆280)（U.S. Patent 5436149），Stoffel(∆289)（Lawyer, 1993），它们本质上是一样的，都是5’-3’外切结构域缺失的突变体。N端删除Taq的耐热型、盐离子耐受能力、保真性都有所提高，但持续合成能力显著下降，对引物3’端错配的敏感性明显降低，这说明5’-3’外切结构域对酶的整体构象可能有很大的影响。研究人员发现大肠杆菌pol I后，又发现一种N端截短的Klenow片段，后者在DNA扩增上具有更好的表现，因此，研究人员得到Taq DNA聚合酶后，发现它与pol I有很多相似之处，自然而然的会进行这种尝试。根据结构或功能相似的酶对目标酶进行结构域编辑或者氨基酸替换，是一种常用的分子改造策略。

    1.2    Sanger测序突变体。

            使用Taq作为测序酶时发现，Taq无法掺入顺利ddNTP（除ddGTP），Tabor等（Tabor, 1995）通过F667Y突变体解决了这个问题。但是Taq(F667Y)掺入ddNTPs的速率不均匀，强烈偏向ddGTP，Li等（1999）在Klentaq1与ddNTP复合物晶体结构的基础上，对R660残基进行突变，结果R660D/F667Y双突变体掺入ddGTP与其它双脱氧核糖核苷酸的速率基本一致。根据酶-底物复合物的晶体结构对酶进行理性设计是一种常用的酶进化方式，当然也比较有难度，很多时候酶-底物的晶体甚至酶的晶体不易得，即使得到晶体结构，也很难判断关键的氨基酸。通常的做法是根据酶-底物的分子相互作用，扫描活性口袋的氨基酸，这种方法经常能在增强底物亲和力、拓宽底物谱方面得到满意的结果。

2.   通过定向进化得到的突变体

       定向进化是一种十分强大的酶分子改造技术，与理性设计的“所见即所得”不同，它的的特点是“所筛即所得”。定向进化允许构建庞大的突变体库，这就让酶有了各种可能（在自然界中这可能需要几百万年以上的时间），只要找到高效的筛选方法，一般都能得到令人惊喜的结果。构建突变体的方法有易错PCR、DNA改组、交错延伸PCR、体外随机延伸PCR等，筛选一般包括初筛与复筛，初筛依靠添加筛选压力让目标突变体留存下来，复筛将留存下来的克隆进行性能比较，从而选出***的突变体。筛选的主要压力来自于初筛，必须具有高通量的方法，因为突变体库多样性可达10⁸-10⁹，一般采用与显色化学反应，酶促反应偶联产生便于观察的信号。

分隔式自我复制技术CSR

分隔式自我复制技术是聚合酶和其他酶的定向进化的一个新方法。

2001年，Ghadessy等人开发了一种分隔式自我复制技术，Compartmentalized Self-replication，CSR。CSR技术通过油与水的混合，形成一个个微小的油包水体系，每个体系就好像一个独立的隔离室，里面含有携带Taq DNA聚合酶突变体的大肠杆菌、Taq DNA聚合酶的引物、PCR buffer和dNTP。在高温条件下，油包水体系仍具有很高的稳定性，通过预热变性，大肠杆菌释放出Taq DNA聚合酶，通过PCR循环，在筛选压力条件下，具有高活性的突变体以自身基因为模板，进行PCR扩增，无义突变体被淘汰。反应结束，纯化被富集的DNA产物，就可以得到了优秀的突变体基因。

图. CSR方法原理图解。(P. DeLisa et al. 2016)

(1)   在大肠杆菌中克隆并表达DNA聚合酶基因文库，球形代表有活性的聚合酶分子。

(2)   表达克隆了聚合酶基因的细胞被分隔放入含有dNTPs/xNTPs和引物的油和水的乳液。

(3)   这一步有两种选择：

     A. 在选择性条件下进行分隔式自我复制CSR，以优先扩增高活性DNA聚合酶（绿色圆圈）的基因，而不是低活性DNA聚合酶（红色六边形） 。

     B.   在步骤(4)之前，利用生物素标记引物对生产性聚合酶基因进行分隔化自我标记（CST）。

(4)   链霉亲和素沉淀（Pinheiro等，2012）。

最后，聚合酶从细胞中释放出来，进行自我复制。 活性低的聚合酶（红色六边形）无法复制其编码基因。释放后代聚合酶基因，并重新克隆，以进行另一轮CSR。

该流程图已被用于产生其具有增强的热稳定性的新聚合酶，绕过阻塞损害、增强的DNA结合亲和力、对抑制剂的抗性、降低的尿嘧啶结合，最终合成非天然基因聚合物（Arezi et al.，2014、Ghadessy et al.，2001、Ghadessy et al.，2004，Pinheiro等人，2012年，Tubeleviciute和Skirgaila，2010年）。

绿色条代表多聚酶变体的基因；红条代表低活性聚合酶变体的基因。

Ghadessy团队得到两个突变体：T8（F73S, R205K, K219E, M236T, E434D, A608V），在97.5°C下的半衰期提高11倍，但催化效率和保真性有所下降；H15（K225E, E388V, K540R, D578G, N583S, M747R），对高浓度肝素抑制剂抗性提高130倍以上，但耐热性显著下降，催化活性也有下降。虽然本次研究没有得到非常优秀的突变体，但CSR技术为热稳定DNA聚合酶的定向进化提供了高效筛选方法，这种方法远比结果更有意义。

   2.1   热启动突变体。

           Kermekchiev等（Kermekchiev, 2003）以Klentaq为模板，通过易错PCR得到突变体库，然后利用一种基于放射性dNTP标记的在位筛选方法得到一个Klentaq Cs3AC（E626K，I707L）突变体，该突变体在37℃时活性明显降低，但68℃时仍保持正常活性，是一款**潜力的热启动酶。2009年，该团队在Cs3AC的基础上对706-708残基进行饱和扫描突变，经过筛选得到一个突变体Klentaq 10（E626K， I707L，E708K），该突变体的全血抑制抗性、土壤抑制抗性、荧光染料抑制抗性比野生酶都有提高，研究人员将三个氨基酸替换平移到全长Taq DNA聚合酶上之后，得到一突变体Taq 22（E626K， I707L，E708Q）抑制剂抗性比野生Taq显著提高。Taq 22不但获取了冷敏感特征，提高了抑制剂抗性，还保持了野生Taq的热稳定性和催化活性，如果配合TP7抗体，具有“热启动”PCR试剂盒开发的潜力。

   2.2 逆转录活性突变体。

          野生型Taq DNA聚合酶没有逆转录活性，但Sauter等（Sauter, 2006）以KlenTaq为模板通过易错PCR和微孔板筛选，得到两个逆转录活性提高的突变体：KlenTaq M1（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G），KlenTaq M2（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G，L789F）。为了将这种增强的逆转录活性用于基于探针的一步法RT-qPCR检测，Kranaster等人（Kranaster, 2010）将KlenTaq M1的突变平移到全长Taq上，得到一个新突变体Taq M1，结果Taq M1既基本保留了野生Taq酶的PCR性能，又显著增强了逆转录活性。Blatter等人（Blatter, 2013）进一步将M1的突变与M747K（Gloeckner, 2007）混组，得到一个新突变体RT-KTq2（L459M，S515R，I638F，M747K），RT-KTq2的逆转录能力比KlenTaq M1更强，并且DNA模板扩增能力也有所提高。RT-KTq2的高耐热性有利于提高RT-PCR的特异性，RT-KTq2无RNase H活性，降低了RNA损伤，因为兼具DNA聚合酶活性，可以实现了逆转 - 扩增 - 酶化。Blatter等用RT-KTq2对几个人源基因进行的基于SYBR的RT-qPCR检测，得到了不错的扩增曲线，但作者没有与商品化MMLV/Taq逆转录试剂盒对比，如果RT-KTq2能达到或接近MMLV的逆转录活性，那么RT-KTq2能够成为一款优秀的逆转录扩增酶。

   2.3   抑制剂抗性突变体。

           从各种各样的样本中进行核酸检测，是PCR的一个重要应用领域。一般的PCR流程是，首先从样本中提取核酸，再用DNA聚合酶进行PCR扩增，最后根据核酸电泳条带或者荧光信号等方式观察扩增结果。有时候，因为样本的稀有性等原因无法提取DNA，或者基于检测时效性和便利性的考虑，研究人员希望能够直接从样本中扩增靶标基因，比如血液、动植物组织、土壤等。这些样本中的复杂组分可能对DNA聚合酶有很强的抑制作用，失败的扩增会造成假阴性的误判，这促使研究人员通过分子改造，提高聚合酶的抑制剂耐受性。野生型Taq DNA聚合酶对血液、土壤等抑制剂的耐受性很差，N端删除大片段的耐受性有所提高，但仍然难以满足要求。Kermekchiev等人（Kermekchiev, 2009）通过定点饱和扫描突变得到的Klentaq 10和Taq 22突变体，可以耐受25%的全血和15%的土壤提取物，E708残基可能发挥了重要作用。相比一般的定向进化手段，CSR技术为获得高抑制剂耐受性突变体提供了基础。Baar等（Baar, 2011）选择了与Taq DNa聚合酶序列同源性较高的八个物种的聚合酶为亲本，通过StEP技术获得8T嵌合体文库，以泥炭提取物、焦油、腐植酸等抑制剂为筛选压力，经过三轮CSR，得到了一个优秀突变体2D9。2D9是由四种不同的聚合酶混组的嵌合体，在多种抑制剂存在条件下，耐受性都有显著的提高，并且保真度与野生Taq基本一致。

图   不同抑制剂下2D9对野生型Taq酶的相对活力   （Baar C, 2011）

         2014年，该团队（Arezi, 2014; Hogrefe, 2016）通过CSR得到一个新的全长Taq酶突变体Taq 2C2（G59W，V155I，L245M，L375V，E507K，E734G，F749I），对EDTA血耐受比例达到65%，对肝素血耐受达到25%，催化速率也比野生酶有所提高，可以作为直接血液核酸检测试剂盒的聚合酶。2016年，Schafer等以Taq-E507K为亲本，通过定向进化得到一个突变体Taq 15（A61T, K346E, S357C, E507K, I707M, F749I），该突变体对PCR buffer中的缓冲液、盐离子浓度具有极高的耐受性，可以很好的直接从葡萄、马铃薯叶片中扩增大于1Kb的DNA片段，可用于植物叶片直扩PCR试剂盒的研发。

    2.4   快速延伸突变体。

Taq DNA聚合酶在72℃时延伸速率大约是60nt/s，但实际中一般以1kb/min的速率扩增，一般一个PCR扩增下来，需要1-2个小时的时间。对于大样本量的检测或者时间要求急迫的检测，人们希望能够更快的扩增。Taq 2C2突变体的催化效率大约是野生Taq的2倍，氨基酸突变E507K对这种增强作用有重要意义。在一些报道中，直接提高Taq DNA聚合酶Kcat的突变体不多，但一般增加了模板亲和力或容错能力的突变体，往往在较短时间内扩增长片段的能力也同样增强。

   2.5   长片段扩增突变体。

Taq DNA聚合酶在长片段扩增上，最**的成果是Klentaq1与Pfu混合酶（Barnes, 1994; U.S. Patent 5436149），可以扩增长达35kb的Lambda DNA片段，保真性也比Taq DNA聚合酶显著提高，但单独的Klentaq1持续合成能力是显著下降的（比Taq低10倍）。Ignatov等人（US 11/658, 610）将Tth DNA polymerase（该酶的扩增能力高于Taq，但区分对引物3’错配不敏感）的N端4-600多肽与Taq DNA polymerase的C端554-832多肽拼接成一个新的嵌合体酶Tth-Taq，嵌合体的扩增能力接近Tth，延伸能力比Taq酶显著提高。将具有DNA结合能力的ssDNA或dsDNA结合蛋白与Taq DNA聚合酶融合，也能提高酶的延伸能力，但真正意义上的长延伸突变体，还是Yamagami等（Yamagami, 2014）通过对E742和A743的扫描突变得到的。E742A和A743H两个突变体能够很好的从Lambda DNA上扩增15kb的长片段（条件：99℃ 5 s，66℃ 5 min，30个循环）。然而有意思的是，E742A/A743H双突变体的引物延伸能力比单突变强得多，但PCR效果却不如单突变体。凝胶迁移实验的结果表明，双突变体与DNA产物有更强的结合能力（在电泳图上产生拖带），这可能不利于PCR起始阶段的扩增，导致PCR失败。研究人员在融合Sso7d结构域与KOD DNA聚合酶时，也发现了类似的情况。有研究人员认为，Taq DNA聚合酶校正活性的缺失限制了其长片段扩增能力，因为随着目标产物长度的增加，延伸过程出错配的概率也就越高，阻挡了继续延伸，保真酶因为能切除错配，往往具有更强的持续延伸能力。这个解释符合事实，长片段延伸突变体除了提高Taq DNA聚合酶的DNA亲和力，也可能增加了“容错”能力，实际上是降低了保真性，这类突变体的实际应用意义不太大，高保真聚合酶在这方面明显具更有优势。

   2.6   RNA聚合活性突变体。

对Taq DNA聚合酶底物谱的改变，是其分子改造的一个重要成果之一，除了前面介绍的增强Taq DNA聚合酶掺入ddNTP、dNTP标记物等非标准脱氧核糖核苷酸的突变体，还有些研究将Taq DNA聚合酶变成了Taq RNA聚合酶。Xia等人（Xia, 2002）以Stoffel片段为模板，通过基于噬菌体展示的定向进化，将其RNA聚合活性提高10³-10⁴。

Ong等人（Ong J L, 2006）通过一种称为short-patch CSR的定向进化方法，得到一个突变体AA40（E602V，A608V，I614M，E615G）能够以与wt酶掺入dNTPs相同的催化效率掺入NTPs和dNTPs。

   2.7   跨损伤扩增突变体。

Taq DNA聚合酶的跨损伤突变体，大多是由使用CSR技术而闻名的Holliger实验室完成的。d'Abbadie等人（d'Abbadie, 2007）以Taq、Tth、Tfl三种聚合酶为亲本，经StEP混组和三轮CSR筛选得到若干突变体，扩增47,000-60,000年前的洞熊DNA时，成功率比野生酶显著提高。Loakes等人（Loakes, 2009）通过CSR得到一个突变体5D4，能过聚合疏水性碱基类似物，后来Millar等人（2015）将5D4用于重亚硫酸盐测序，结果发现5D4能够很好的跨过DNA损伤。此外，Obeid等人（Obeid, 2011）以KlenTaq为模板，通过定向进化得到两个突变体I614K和M747K，它们获得了增强的跨损伤扩增能力。Obeid将I614K和M747K组合在一起后，双突变体的跨损伤扩增能力修复能力比单突变体显著增强。不过，这些突变体跨损伤能力的增强，是以牺牲保真性或者正常DNA扩增效率为代价的，它们应用范围比较狭窄，商业化价值不是太大。

3. 通过结构域融合得到的突变体

   3.1 结构域融合突变体。

一些来源于嗜热菌的的α-螺旋结构具有稳定DNA的作用，Pavlov等人（Pavlov, 2002）将DNA拓扑异构酶V上一段重复的螺旋-发夹-螺旋结构融合到Taq DNA聚合酶的N端和C端，结果N端融合酶TopoTaq对Na+、K+、甜菜碱的耐受能力显著提高，并且耐热性也有很显著的增强。Davidson等人（Davidson, 2003）将Taq DNA聚合酶的480-485残基替换为T3 DNA聚合酶的硫氧还蛋白结合域（TBD），结果融合体的合成能力提高了20-50倍，移码突变概率降低6-7倍。后来，Wang等人（Wang, 2004）将来自Sulfolobus solfataricus的Sso7d双链DNA结合蛋白，融合在Taq和Stoffel片段的N端，结果发现S-Taq与S-Stoffel的持续合成能力比之前显著增强，融合蛋白与野生酶的Kcat基本一致，但Km比野生酶降低4-8倍，融合蛋白还增加了对盐离子的耐受性，令人兴奋的是融合蛋白还没有改变酶的耐热性和保真性。Sso7d的融合“红利”在家族B的Pfu DNA聚合酶上效果更明显，风靡市场的Phusion高保真聚合酶就是Pfu-sso7d。

图   Taq，Stoffel和S-Stoffel的PCR效率比较（Wang Y, 2004）。 以DNA（130pg/ml）为模板，扩增子的大小显示在底部。 PCR程序为：95°C 20s； 94°C 5s，72°C 30s（A）或60s（B）或2min（C），20个循环； 72°C 7分钟。

总结

CSR在Taq DNA聚合酶定向进化上的应用，改变了Taq DNA聚合酶及其他耐热型DNA聚合酶分子改造的面貌。虽然Baar等人（2011）认为CSR继承性的选择聚合酶保真性，这是其自身的特征，因为这种“自我复制”必须在“错误阈值”内进行。他们的意思应该是：如果CSR筛选到的聚合酶保真性显著下降，那么在CSR过程中就会引入随机突变，而这种随机突变可能改变原来的性质，比如降低了对筛选的压力的抗性，那么CSR就会无法进行下去，即“突变者，死”，因此CSR在聚合酶保真性上具有内在稳定性。

这种解释有一定道理，但不能保证CSR的保真性，理由有两个：

1. 除非保真性发生数量级程度的下降，一般程度的下降，可能对于2.5kb左右的模板，并不会产生大量随机突变；

2. 即使发生稳定遗传的随机突变也可能不会显著影响针对筛选压力的性能。当然，我们也不能否认传统定向进化方法对Taq DNA聚合酶改造的贡献，这种方法需要大量挑选克隆子，然后进行活性分析，是一项十分繁重的工作。相比之下，理性设计或者基于已知位点的突变组合，针对性强的多，它需要以酶和酶-底物复合物的晶体结构为依据。对同源性较高的不同DNA聚合酶进行混组，是一种不错的体变体构建方式，尤其是选取功能互补的亲本。

Taq DNA聚合酶具有两种形式，全长和N端删除大片段（统称Klentaq）。研究认为5’-3’外切结构域耐热型不如聚合结构域，因此Klentaq的热稳定性高于全长酶，外切结构域具有DNA结合作用，能阻止聚合酶与模板的彻底解离，因此全长酶具有更强的持续合成能力。虽然5’-3’外切结构域在空间上似乎与聚合结构域相互分离，但根据前文列举的突变体，不难发现，5’-3’外切结构域对全长酶的底物特异性也有很大影响，可能5’-3’外切结构域的离去改变了聚合结构域的构象。从PDB数据库下载了全长酶与Klentaq的三维结构数据，通过结构拟合发现，全长酶与Klentaq的聚合酶结构域确实存在几个无法重叠的α螺旋。

全长Taq与KlenTaq的结构拟合。选取全长Taq的三维结构（PDB:1TAQ）和KlenTaq三维结构（PDB:4ELU），使用SPDBV执行Magic Fit。两处箭头代表全长片段与KlenTaq片段不重叠的二级结构，有多处不重叠，主要集中在拇指域和手指域，这两个区域是已知的底物特异性的关键区域，两者的差异正好说明了两者在底物特异性上的差异。

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