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用CRISPR Cas13a编辑RNA

作者:Julia

广州美格生物提供全系列的CRISPR Cas蛋白、恒温扩增试剂、逆转录酶、侧向层析试纸条,用于基因编辑、快速检测。想了解详情,请点击:CRISPR Cas蛋白恒温扩增试剂逆转录酶侧向层析试纸条



在生物学中,RNA具有非常重要的作用,但操纵和测量它的分子工具是有限的。例如,RNA干扰可以有效地敲低RNA,但它易于产生脱靶效应,并且可视化RNA通常依赖于外源标签的引入。

如何用CRISPR Cas13a编辑RNA?

在这里,美格君推荐一篇大牛张锋团队的2017年的文章,看看张锋同志的方法对大家有没有启发。

张锋的原文是:RNA targeting with CRISPR Cas13a,详情可以查阅原文。


文章摘要

我们(张锋团队)证明了2类VI型、由RNA引导的RNA靶向CRISPR-Cas蛋白的效应子CRISPR Cas13a蛋白(以前称为C2c2)可以被设计用于哺乳动物细胞RNA敲低和结合。

在初步筛选15个直向同源物后,我们鉴定了来自Leptotrichia wadei(LwaCas13a)的Cas13a蛋白,在大肠杆菌中的干扰测定中最有效。

CRISPR LwaCas13a蛋白可以在哺乳动物和植物细胞中异源表达,用于靶向敲低报告基因或内源转录物,具有与RNA干扰相当的敲低水平和改善的特异性。

催化失活的LwaCas13a,维持靶向RNA结合活性,我们利用它来可编程跟踪活细胞中的转录物。结果表明,CRISPR–Cas13a蛋白是研究哺乳动物细胞中RNA和治疗发展的一个灵活平台。

为了实现稳健的CRISPR Cas13a蛋白介导的RNA敲低,我们首先使用先前描述的氨苄青霉素抗性测定(图1a)评估了15个Cas13a直向同源物的原型间隔区侧翼位点(PFS)偏好和活性。该测定监测Cas13a介导的β-内酰胺酶(氨苄青霉素抗性)转录物的切割,导致氨苄青霉素选择下的细菌死亡,其可以通过定量存活的菌落来测量。使用这种方法,我们发现,来自L.wadei(LwaCas13a)的Cas13a直向同源物最活跃,其次是先前表征的LshCas13a蛋白(来自Leptotrichia shahii)(图1b)。

对来自LwaCas13a和LshCas13a筛选的测序的PFS分布的分析显示,大多数LwaCas13a PFS序列被耗尽。在不同阈值下耗尽的PFS序列的Motif基序分析揭示了LshCas13a的预期3'H基序,但LwaCas13a没有显着的PFS基序(图1c)。该观察结果与先前的研究一致,其显示LwaCas13a比LshCas13a作为核酸传感器更具活性。由于其高活性和细菌中缺乏PFS,我们专注于LwaCas13a蛋白的进一步开发。

CRISPR LwaCas13a蛋白的体外切割反应证明,可编程RNA使用编码28个核苷酸(nt)间隔区的CRISPR RNA(crRNA)进行切割,短于天然L.wadei CRISPR阵列中发现的29-30nt长度。

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图1.

这些反应证实了CRISPR LwaCas13a比LshCas13a有更高的切割效率,并揭示了两种酶的相似生化特征,包括切割相应的pre-crRNA转录物。我们还通过截短间隔区,探索了对LwaCas13a切割的crRNA限制,发现间隔区长度短至20nt,LwaCas13a蛋白也保留了体外切割活性。尽管小于20 nt的引导长度不再支持催化活性,但LwaCas13-crRNA复合物仍可保留结合活性,为单一酶的正交应用提供了机会。

我们接下来评估了CRISPR LwaCas13a切割哺乳动物细胞中转录物的能力。我们将哺乳动物密码子优化的LwaCas13a蛋白克隆到哺乳动物表达载体中,在C或N末端具有msfGFP融合体,并且具有双侧翼核输出序列或核定位序列(NLS),并评估表达和定位(图1d)。我们发现msfGFP融合的LwaCas13a构建体表达良好,并根据定位序列有效定位于细胞质或细胞核。为了评估LwaCas13a的体内切割活性,我们开发了双荧光素酶报告系统,其在同一载体上的不同启动子下,表达Gaussia荧光素酶(Gluc)和Cypridinia荧光素酶(Cluc),允许一个转录物充当LwaCas13a蛋白靶标。另一个用作剂量控制(图1e)。

然后,我们设计了针对Gluc的向导,并将它们克隆到tRNAVal启动子驱动的指导表达载体中。我们将LwaCas13a表达载体,指导载体和双荧光素酶构建体转染到HEK293FT细胞中,并在转染后48小时,测量荧光素酶活性。我们发现LwaCas13a-msfGFP-NLS导致最高水平的敲低(向导1为75.7%,向导2为72.9%),与位置匹配的短发夹shRNA对照相当(向导1为78.3%,向导251.5%)(图1f),这是目标区域的可访问性和序列对照;因此,我们将此设计用于所有进一步的敲低实验。

我们还发现间隔长度为28 nt(73.8%),敲低效率最高,对输入蛋白和指导载体量均有剂量反应,对RNA聚合酶III启动子选择不敏感。

我们接下来测试了三种内源基因KRAS,CXCR4和PPIB在HEK293FT细胞中的敲低。我们观察到不同水平的敲低;对于KRAS和CXCR4,LwaCas13a敲低(PPIB为40.4%,CXCR4为83.9%,KRAS为57.5%)与位置匹配shRNA的RNA干扰(RNAi)相似(PPIB为63.0%),CXCR4为73.9%,KRAS为44.3%)(图1g)。我们还发现用U6或tRNAVal启动子可以敲低KRAS。

在A375黑素瘤细胞系中获得了类似的结果。在所有测试的情况下,通过突变CRISPR/LwaCas13a蛋白的催化结构域来消除敲低。

为了测试CRISPR/Cas13a蛋白敲低在植物中是否有效,我们每个转录物用三个向导靶向三个水稻(Oryza sativa)基因,并且共转染CRISPR LwaCas13a和向导载体到O.sativa原生质体中(图1h)。

转染后,我们观察到9个向导中有7个敲低大于50%的,最大敲低率为78.0%(图1i)。

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图2.

为了评估CRISPR LwaCas13a敲低的效率范围,我们按照四种转录物的长度:Gluc,Cluc,KRAS和PPIB,平铺向导(图2a)。

Gluc和Cluc平铺筛选显示,向导敲除率大于60%导(图2b,c),大多数Gluc靶向向导显示敲低率大于50%,最高达83%。

为了比较LwaCas13a敲低与RNAi,我们选择了针对Gluc和Cluc的前三个执行向导,并将它们与位置匹配的shRNA进行比较。

我们发现六个表现最佳的向导中有五个,达到比其对应的shRNA显着更高的敲低水平(P<0.05)。

对于内源基因,我们发现,虽然敲低效率是转录依赖性的,但KRAS和PPIB的最大敲低率分别为85%和75%(图2d,e)。

我们从KRAS和PPIB的平铺筛选中选择了前三个向导,观察到CRISPR LwaCas13a的稳健敲低率(53.7-88.8%)相当于shRNA敲低的水平(61.8-95.2%),对于六个向导中的两个,shRNA显着更好(P<0.01),LwaCas13a显著优于六个向导中的两个(P<0.01)(图2f)。

LwaCas13a蛋白还可以介导核转录物MALAT1和XIST的显着敲低,而位置匹配的shRNA显示没有可检测的敲低(P>0.05)(图2g)

LshCas13a活性受大肠杆菌中目标可及性的控制,因此我们使用来自四个平铺筛选的数据,来研究LwaCas13a活性是否高于位于可访问性区域的向导。我们发现最有效的向导比随机预期的更接近,预测的目标可及性可以解释靶向功效的一些变化(敲低变异的4.4-16%)。

由于CRISPR Cas13a蛋白可以处理自己的pre-crRNA,因此它提供了多路复用递送LwaCas13a向导的可能性。

我们针对内源性PPIB,CXCR4,KRAS,TINCR和PCAT转录设计了五种不同的向导,在U6启动子的表达下,用侧翼为36-nt直接重复序列(代表未处理的直接重复序列和截短间隔区)、28-nt引导的CRISPR阵列输送这个靶向系统。

我们发现与单个或组合的向导对照相当的每个基因的敲低水平(图2i)。为了评估这种情况下的特异性,我们测试了针对PPIB,CXCR4和KRAS的三种向导或三种变体的多重递送,其中三种向导中的每一种都被非靶向向导替换。

我们发现,在阵列中没有向导的情况下,只有目标转录被减少(图2j)。

为了进一步研究CRISPR LwaCas13a在体内的特异性,我们将单个错配引入靶向Gluc(图3a)或内源基因(图3b)的向导,也同样测试引入双重错配(图3c)的向导中(图3c)。

我们发现敲低对引导目标双链体中央种子区域的错配敏感,我们还通过生化分析证实了这一点。为了全面探索CRISPR LwaCas13a敲低的脱靶效应,我们进行了全转录组的mRNA测序。我们用CRISPR LwaCas13a蛋白或位置匹配的shRNA构建体靶向Gluc转录物,发现靶转录物的显著敲低(P<0.01)(图3d,e)。

当靶向KRAS和PPIB时,发现相同的结果(P<0.05)。差异表达分析表明,在每种shRNA条件下,有数百个显着的脱靶,但在LwaCas13a条件下没有(图3f),尽管靶转录物的敲低水平相当(shRNA为30.5%,43.5%和64.7%),LwaCas13蛋白分别为62.6%,27.1%和29.2%,分别为Gluc,KRAS和PPIB)(图3g)。

对Gluc靶向RNA-seq比较的进一步分析表明,由于这些脱靶效应,shRNA文库与LwaCas13a蛋白相比,在靶向和非靶向条件之间显示出更高的变异性。

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图3.

LshCas13a的附带活性已在体外生物化学实验直接观察到,通过细菌中的生长抑制也间接观察到,但这种活性在哺乳动物细胞中的程度尚不清楚。

多重留一法和RNA测序(RNA-seq)分析表明,缺乏附带RNA降解。我们通过重新分析敲低平铺筛选(图2b-e)验证了这一假设,发现对照基因的表达与靶基因的表达不相关(Gluc:R=0.078,P>0.05;PPIB:R=0.058,P>0.05;KRAS:R=0.51,P<0.001)。

此外,在RNA-seq实验中,除了靶基因之外没有差异表达的基因,表明CRISPR/Cas13a蛋白靶向不会在转录组水平上导致可观察到的细胞应激反应(图3d)。

此外,CRISPR Cas13a蛋白介导的靶向转录物的敲低不影响表达相似水平的CRISPR LwaCas13a的哺乳动物细胞的生长(图3h)。最后,由于哺乳动物细胞中非特异性RNA核酸酶的激活导致RNA大小分布的可检测变化,我们检测了CRISPR LwaCas13a敲低Gluc转录物后细胞中的全局RNA降解,发现靶向和非靶向条件之间的RNA完整性没有差异(P>0.05)。

为了扩展CRISPR LwaCas13a蛋白作为研究RNA的工具的效用,我们通过突变催化精氨酸残基创建了催化死亡变体(dLwaCas13a)。我们使用含有36-nt直接重复序列和28-nt间隔区的向导,用RNA免疫沉淀法(图4a),对被dLwaCas13a蛋白绑定的RNA进行定量。

我们发现,靶向萤光素酶转录物或ACTB mRNA的dLwaCas13a的pulldown(图4b)导致相应靶标相对于非靶向对照的显着富集(萤光素酶富集7.8-11.2倍,ACTB富集2.1-3.3倍;P<0.05),证实dLwaCas13a蛋白是可重编程的RNA结合蛋白。

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图4.

dLwaCas13a蛋白的一个应用是作为转录成像平台。为了减少由于未结合的蛋白质引起的背景噪音,我们引入了基于锌指结构自靶向和KRAB结构域抑制的负反馈(NF)系统(图4c)。

与dLwaCas13a相比,当靶向ACTB mRNA时,dLwaCas13a-NF有效地从细胞核转移到细胞质。

为了进一步表征dLwaCas13a-NF的易位,我们用两个向导靶向ACTB转录本,发现与非靶向向导相比,两个向导都增加了易位(3.1-3.7×细胞/核信号比;P<0.001)(图4d,e)。

为了验证dLwaCas13a-NF成像,我们分析了dLwaCas13a-NF信号与ACTB mRNA荧光原位杂交(FISH)信号(扩展数据图10a)的相关性,发现靶向指导与非靶向指导条件存在显着相关性和信号重叠(向导1和2分别为R=0.27和0.30,对于非靶向引导条件,R=0.00;P<0.0001)。


使用dLwaCas13a-NF,我们通过将转录本成像与应力颗粒标记G3BP1的可视化相结合,研究了mRNA在应力颗粒中的积累。

在固定样本中,我们发现ACTB靶向向导的dLwaCas13a-NF荧光与G3BP1水平显着相关(向导1和向导2分别为R=0.49和0.50,非靶向向导为R=0.08;P<0.001)(图4f,g)。

我们接下来在活细胞中进行了应激颗粒追踪,发现,随着时间的推移,每个细胞中,相对应于非靶向对照,靶向ACTB的dLwaCas13a-NF定位于显着更多的应激颗粒(P<0.05)。

这些结果表明CRISPR Cas13a蛋白可以用向导RNA重编程以有效敲低或结合哺乳动物细胞中的转录物。

CRISPR LwaCas13a敲低与RNAi敲低效率相当,但脱靶显着减少,使其可能非常适合治疗应用。此外,它可以介导核RNA和多重敲低。

我们调整用于实时成像转录本追踪的无催化活性的dLwaCas13a可用作可编程RNA结合蛋白。

我们预计LwaCas13a蛋白和dLwaCas13a蛋白将有其他应用,如全基因组合敲低筛选,lncRNA和新生转录功能的询问,用于研究RNA-蛋白质相互作用的下拉分析,翻译调节和RNA碱基编辑。

重要的是,我们没有观察到CRISPR LwaCas13a在哺乳动物细胞中的附带活动的任何证据。

我们的数据显示CRISPR LwaCas13a在哺乳动物和植物细胞中具有广泛功效和高特异性的功能,为一系列转录组分析工具和治疗方法提供平台。

方法材料

没有统计方法用于预先确定样本量。实验不是随机的。在实验和结果评估期间,研究人员并不是盲配。

用于活性筛选和重组表达的直向同源物的克隆

我们合成了15个CRISPR Cas13a直向同源物(Genscript)的人密码子优化版本,并将它们克隆到pLac启动子下的pACYC184中。与CRISPR Cas13a表达盒相邻,我们克隆了直向同源物相应的直接重复序列,侧翼为β-内酰胺酶靶向或非靶向间隔区。间隔区阵列表达由J23119启动子驱动。也可以购买市售的CRISPR Cas13蛋白,如IDT,Magigen CRISPR Cas13a蛋白。

为了纯化LwaCas13a,我们将哺乳动物密码子优化的LwaCas13a序列克隆到细菌表达载体中进行蛋白质纯化(6×His/Twin Strep-SUMO)。

细菌体内测试CRISPR Cas13a活性和PFS鉴定

简而言之,对CRISPR Cas13a蛋白进行编程以靶向侧翼为随机PFS核苷酸的β-内酰胺酶转录物上的5'延伸序列。氨苄青霉素选择下,CRISPR Cas13a切割活性导致细菌死亡,随后通过下一代测序分析PFS消耗。

为了测试CRISPR Cas13a蛋白直向同源物的活性,将90ng具有靶向或非靶向指导的直向同源物表达质粒,与25ng先前描述的β-内酰胺酶靶质粒共转化到NovaBlue Singles Competent Cells (Millipore)中。

转化后,将细胞稀释,铺在补充有100μg/μl-1氨苄青霉素和25μg/μl-1氯霉素的LB琼脂上,并在37℃下孵育过夜。第二天计算转化体。

为了测定LshCas13a和LwaCas13a PFS同一性,每个生物学重复,将40ng具有靶向或非靶向间隔区的直向同源物表达质粒与25ngβ-内酰胺酶靶质粒共转化为两个等份的NovaBlue GigaSingles(Millipore)。进行两次生物学重复。

转化后,每次生物学重复,在37℃下,在500μLSOC(ThermoFisher Scientific)中,将细胞恢复1小时,涂布在补充有100μg/μl-1氨苄青霉素和25μg/μl-1氯霉素的LB琼脂(Affymetrix)的生物测定板(Corning)上,并在37℃温育16小时。

然后通过刮擦收获菌落,并用NuceloBond Xtra EF(Macherey-Nagel)纯化质粒DNA用于随后的测序。

使用NEBNext High Fidelity 2X Master Mix(New England Biosciences),利用条形码引物和Illumina   flowcell handles,通过PCR,制备收获的质粒样品,用于下一代测序。

合并PCR产物,并使用Zymoclean凝胶提取试剂盒(Zymo Research)进行凝胶提取,并使用MiSeq下一代测序仪(Illumina)进行测序。

PFS的计算分析

从LshCas13a和LwaCas13a PFS筛选文库的新一代测序数据中,我们比对随机化PFS区域侧翼的序列,并提取PFS识别。

我们将PFS识别折叠为四个核苷酸,以提高序列覆盖率,计算每个唯一PFS的频率,并对每个文库的的总读取计数进行标准化,参数pseudocount=1。

如扩展数据Fig 1c中所示,每个分布的富集,针对pACYC184对照(无蛋白质/指导基因座),计算公式为

-log2(fcondition/fpACYC184),其中fcondition是实验条件下PFS识别的频率,fpACYC184是pACYC184对照中PFS识别的频率。

为了分析一个保守的PFS基序,利用每个条件的非靶向对照计算最高的耗尽的PFS识别,

公式:-log2(fi,targeting/fi,non-targeting),其中fi,targeting是条件i中PFS识别的频率,带有靶向间隔子和fi,非靶向是条件i中具有非靶向间隔物的PFS识别的频率。


CRISPR LwaCas13a蛋白的纯化

如前所述进行CRISPR LwaCas13a蛋白的纯化。简而言之,将CRISPR LwaCas13a细菌表达载体转化到Rosetta 2(DE3)pLysS singles Competent Cells (Millipore)中,并用起始培养物接种4μlTerrific Broth 4生长培养基。

用4 l Terrific Broth 4生长培养基作为起始培养。

用IPTG诱导细胞蛋白表达,过夜生长后,收获细胞沉淀,并保存在-80°C。细胞裂解后,使用 StrepTactin Sepharose resin (GE)结合蛋白,并通过SUMO protease digestion (ThermoFisher)洗脱蛋白。

使用HiTrap SP HP cation exchange column(GE Healthcare Life Sciences),通过阳离子交换,随后使用Superdex 200 Increase 10/300 GL column(GE Healthcare Life Sciences),通过凝胶过滤,进一步纯化蛋白质,两步均通过FPLC(AKTA PURE,GE Healthcare Life Sciences)。

合并含有CRISPR LwaCas13a蛋白的最终组分,并浓缩到储存缓冲液(600mM NaCl,50mM Tris-HCl pH 7.5,5%甘油,2mM DTT)中,并将等分试样,在-80℃冷冻,以长期储存。


哺乳动物和植物表达构建体的克隆

合成人密码子优化的CRISPR Cas13a基因(Genscript)并克隆到具有核输出序列或在EF1-a启动子表达下的NLS的哺乳动物表达载体中。由于单体超折叠GFP(msfGFP)赋予的稳定性,我们将msfGFP融合到LwaCas13a蛋白的C末端。

通过在两个HEPN结构域中引入R474A和R1046A突变,产生了无催化活性的LwaCas13a–msfGFP构建体(死的LwaCas13a或dLwaCas13a)。

要生产药物筛选版本的LwaCas13a–msfGFP,需要将蛋白克隆到骨架中,该骨架具有杀稻瘟素筛选标记,通过2A肽序列与C末端连接。

dLwaCas13a-msfGFP构建体(dLwaCas13a-NF)的负反馈版本是通过克隆dLwaCas13a-msfGFP启动子上游的锌指结合位点,并将锌指和KRAB结构域融合到C末端而产生的。

通过在单个载体上克隆在CMV启动子表达下的Cypridinia荧光素酶Cluc和在EF1-a启动子表达下的Gaussia荧光素酶Gluc来产生报道荧光素酶构建体。

两种荧光素酶在单个载体上的表达允许一种荧光素酶用作剂量对照,标准化另一种荧光素酶敲低,控制由于转染条件引起的变异。

对于图1g中的内源性敲低实验,使用RNAxs siRNA设计算法20来设计向导和shRNA。预测工具用于设计shRNA,并且向导设计在相同位置,以允许shRNA和CRISPR LwaCas13a敲低之间的比较。

对于植物敲低实验,用PCR从pANIC6A扩增水稻肌动蛋白启动子pOsActin,用PCR从人表达LwaCas13a蛋白构建体扩增LwaCas13a。

将这些片段连接到现有的植物表达质粒中,使得CRISPR LwaCas13a蛋白由水稻肌动蛋白启动子驱动,并且转录由HSP终止子终止,而LwaCas13a gRNA由水稻U6启动子pOsU6表达。


原生质体制备

如前所述制备绿稻原生质体 (O. sativa L. ssp. japonica var. Nipponbare) ,稍作修改。

幼苗生长14天,原生质体重悬于含有0.1M CaCl 2的mMG缓冲液中。该修饰的mMG缓冲液用于制备新鲜的40%PEG缓冲液以及代替WI缓冲液。最后,将原生质体在转化后完全黑暗中保持48小时。所有其他条件如前所述。

制备用于体外反应和附带活性测定的核酸靶标和crRNA

为了产生核酸靶标,用KAPA Hifi Hot Start(KAPA Biosystems)试剂,PCR扩增寡核苷酸。

使用MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen)对dsDNA扩增子进行凝胶提取和纯化。

所得纯化的dsDNA,在30℃下,用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit(New England Biolabs)试剂,过夜孵育,被转录。

使用MEGAclear Transcription Clean-up kit (Thermo Fisher)试剂纯化转录的RNA。

为了制作crRNA,订购寡核苷酸,这是具有额外5'T7启动子序列的DNA(Integrated DNA Technologies)。

用T7引物(最后浓度10μM)退火crRNA模板DNA,并通过在37℃下,用HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成试剂盒(New England Biolabs)孵育过夜,转录。

用RNAXP clean beads(Beckman Coulter)纯化得到的转录的crRNA,使用2倍比例的珠子与反应体积,补充额外的1.8倍比例的异丙醇isopropanol(Sigma)。


LwaCas13a蛋白切割和附带活性检测

对于CRISPR LwaCas13a蛋白的生物化学表征,如前所述进行测定。简言之,除非另有说明,否则用160nM末端标记的单链(ss)RNA靶标,200nM纯化的LwaCas13a蛋白和100nM crRNA进行核酸酶测定。

所有测定均在核酸酶测定缓冲液中进行,40mM Tris-HCl,60 mM NaCl,6 MgCl 2,pH 7.3。

对于阵列处理,每个核酸酶测定使用100ng的体外转录阵列。

使反应在37℃下进行1小时(除非另有说明),然后用蛋白酶缓冲液(150U ml-1蛋白酶K,60mM EDTA和4M尿素urea)在37℃下淬灭15分钟。

然后将反应物用4.5M尿素变性缓冲液在95℃变性5分钟。

在45℃下,用10% PAGE TBE-Urea (Invitrogen) ,通过变性凝胶电泳,分析样品。

使用Odyssey扫描仪(LI-COR Biosciences)对凝胶成像。


进行CRISPR Cas13蛋白附带活性检测测定

简而言之,反应构成:45nM纯化的LwaCas13a,22.5nM crRNA,125nM猝灭荧光RNA报道分子(RNase Alert v2,Thermo Scientific),

2μl小鼠RNase抑制剂(New England Biolabs),100ng全人RNA(从HEK293FT培养物中纯化),和不同量的输入核酸靶标,

除非另有说明,反应在核酸酶测定缓冲液(40mM Tris-HCl,60mM NaCl,6mM MgCl 2,pH 7.3)中。

在37℃(除非另有说明),使反应在荧光板读数器(BioTek)上进行1-3小时,每5分钟测量荧光动力。


平铺向导筛选克隆

对于平铺向导筛选,间隔物被设计成以均匀间隔,靶向mRNA转录物,以完全覆盖转录物的整个长度。

将间隔区spacer(从IDT订购)退火并将golden-gate 克隆到具有tRNAval启动子(Gluc和Cluc筛选)或U6启动子(所有内源筛选)的LwaCas13蛋白指导表达构建体中。


CRISPR Cas13a蛋白敲低的哺乳动物细胞培养和转染

除非另有说明,否则所有哺乳动物细胞实验均在HEK293FT品系(美国典型培养物保藏中心(ATCC))中进行。HEK293FT细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养,该培养基中添加了高葡萄糖,丙酮酸钠和GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific),并补充了10%胎牛血清(VWR Seradigm)和1x青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific)。

传代细胞以保持融合度低于70%。对于涉及A375(ATCC)的实验,将细胞在补充有9%胎牛血清(VWR Seradigm)和1x青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific)的RPMI培养基1640(Thermo Fisher Scientific)中培养。

HEK293FT细胞在从ATCC接收后未经鉴定,未检查支原体污染。

为了检测内源基因的敲低情况,用每孔150ng CRISPR LwaCas13a蛋白质粒和250ng向导质粒,除非另有说明。

测试报告质粒敲低的实验补充了每孔12.5 ng报告子构建。转染前16小时,将细胞以每孔约20000个细胞的量接种在96孔板中,并使其一晚生长至90%融合度。

对于每个孔,将质粒与Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher)合并至总共25 μl,单独的0.5 μl Lipofectamine 2000转染试剂与24.5μl的Opti-MEM结合。

然后将质粒与Lipofectamine溶液混合,培养5 分钟,然后缓慢吸移到细胞上以防止破裂。


绿稻原生质体的转化

对于绿稻实验,将表达每种CRISPR LwaCas13a蛋白质粒和相应的指导RNA以等摩尔比混合,使得总共有30μgDNA,用于每次转化200000个原生质体。

荧光素酶活性的测定

除非另有说明,转染后48小时,收获含有萤光素酶分泌的培养基。将培养基在PBS中以1:5稀释,然后使用BioLux Cypridinia和BioLux Gaussia荧光素酶测定试剂盒(New England Biolabs)在Biotek Synergy 4酶标仪上,以injection protocol,测量荧光素酶活性。所有重复均作为生物学重复进行。


总RNA的收获和定量PCR

对于哺乳动物细胞中的基因表达实验,使用先前提到的商业试剂盒Cells-to-Ct kit (Thermo Fisher Scientific),在转染后48小时,进行细胞收集和逆转录以产生cDNA。

然后使用Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)和TaqMan qPCR探针(Thermo Fisher Scientific,补充表8和9)和GAPDH对照探针(Thermo Fisher Scientific),用qPCR定量转录物表达。

所有qPCR反应均是5-μl反应,以384孔形式,进行四次技术重复的反应,并使用LightCycler 480 Instrument II(Roche)读数。

对于多重靶向反应,在不同的孔中读出不同的靶标。通过从目标Ct值中减去看家对照(GAPDH)循环阈值(Ct)来计算表达水平,以标准化总输入,从而得出ΔCt水平。

相对转录丰度计算为:2−ΔCt。所有重复均作为生物学重复进行。

对于植物细胞中的基因表达实验,根据制造商的方案,使用Trizol孵育48小时后,分离总RNA。

根据制造商的协议,将1纳克总RNA用于SuperScript III Plantinum SYBR Green一步qRT-PCR试剂盒(Invitrogen)。

所有样品在LightCycler 480仪器(Roche)上,以384孔格式,做3次三个生物学重复。所有PCR引物在熔解曲线分析的基础上被证实是特异性的,并且如下:

OsEPSP(Os06g04280),5'-TTGCCATGACCCTTGCCGTTGTTG-3'和5'-TGATGATGCAGTAGTCAGGACCTT-3';

OsHCT(Os11g07960),5'-CAAGTTTGTGTACCCGAGGATTTG-3'和5'-AGCTAGTCCCAATAAATATGCGCT-3';

OsEF1a(Os03g08020),5'-CTGTAGTCGTTGGCTGTGGT-3'和5'-CAGCGTTCCCCAAGAAGAGT-3'。

先前已经描述了OsEF1a的引物。

为了分析用CRISPR LwaCas13a敲低后的RNA质量,通过使用TRI试剂裂解细胞并使用Direct-zol RNA MiniPrep Plus试剂盒(Zymo)纯化RNA来收获总RNA。使用RNA 6000 Pico Bioanalyzer试剂盒(Agilent)分析4纳克总RNA。


目标可达性的计算分析

为了首先分析目标可达到性,分析了平铺筛选上的顶部向导,以确定它们是否比预期的更组合紧密,假设如果存在可访问区域,则该区域中的多个向导将预计望高度活跃。

顶部向导被定义为Gluc平铺筛选执行向导的前20%,Cluc,KRAS和PPIB平铺筛选执行向导的前30%。

通过随机模拟10000个引导位置,然后与实验确定的顶部引导成对距离进行比较,为引导之间的成对距离生成零概率分布。

使用 Vienna   RNA软件中的RNApl折叠算法预测了可达性。使用70 nt大小的默认窗口,并将未配对目标区域的概率计算为整个目标区域中28个单核苷酸未配对概率的平均值。

将这些可访问性曲线平滑,并与四个转录本中每个转录本的平滑敲低曲线进行比较,并使用Pearson相关系数与SciPy Python软件包(pearsonr函数)计算两个因素之间的相关性及其显着性。

通过对两个变量执行二维核密度估计,还可以看到这两个因素的概率空间。


RNA测序和分析

为了分析CRISPR LwaCas13a蛋白敲低的特异性,对来自涉及LwaCas13a和shRNA构建体的敲低实验的mRNA进行RNA-seq测序。

使用Qiagen RNeasy Plus Mini kit48小时后,从转染实验中制备总RNA。然后使用NEBNext Poly(A)mRNA磁分离模块提取mRNA,并使用用于Illumina的NEBNext超定向RNA文库制备试剂盒制备RNA-seq文库。

RNA-seq文库在Illumina NextSeq仪器上测序,每个文库至少有1000万个读数。

使用RefSeq GRCh38程序集生成索引,并使用Bowtie和RSEM1.2.31版本,默认参数, 对读数进行比对和定量。

每百万转录本(TPM)值用于表达计数,并通过取log2(TPM++1)转换为对数空间。

为了找到差异表达的基因,对三个靶向重复与三个非靶向重复进行了学生t检验。

在六次重复中至少两次, 对log2(TPM+1)值大于2.5的基因进行统计分析。只有差异表达大于2或小于0.75, 且错误发现率<0.10的基因,才显着差异表达。

使用Kendall的tau系数进行重复和重复平均之间的互相关。通过考虑六个重复(三个靶向和三个非靶向重复)中基因表达的标准偏差的分布,来分析shRNA与LwaCas13a文库的变化,并表示为小提琴图。


细胞活力测定

用荧光素酶报告基因靶标,向导质粒和CRISPR LwaCas13a蛋白或药物筛选的CRISPR LwaCas13a来转染哺乳动物细胞。

转染后24小时,将细胞以1:5分成新鲜培养基,药物筛选的CRISPR LwaCas13a蛋白样品补充10μg ml-1Blasticidin S (Thermo Fisher Scientific)。

在额外48小时的生长后,测定细胞的荧光素酶敲低,通过多模板读数器(Biotek Neo2)上的GFP荧光测量维持LwaCas13a表达,以及通过 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)测定的细胞生长。

定量dLwaCas13a蛋白与RNA免疫沉淀

对于RNA免疫沉淀实验,将HEK293FT细胞铺在六孔板中,并用1.3μg dlwaCas13a蛋白表达质粒和1.7μg向导质粒转染,在涉及报告者靶向的情况下,另外用150ng报告质粒。

转染后48小时,将细胞用冰冷的PBS(Sigma)洗涤两次,并在室温下,在PBS中,用0.2%多聚甲醛paraformaldehyde (Electron Microscopy Sciences)固定15分钟。

固定后,除去多聚甲醛,加入125mM甘氨酸的PBS溶液以淬灭交联,将细胞温育10分钟。用冰冷的PBS洗涤细胞两次,刮取收集细胞,并将细胞悬浮液以800g,离心4分钟,以沉淀细胞。

除去上清液,裂解前用PBS洗涤颗粒。用200μl补充有cOmplete ULTRA Tablets, EDTA-free (Sigma)和核糖核酸酶抑制剂(Sigma R1158)的1×RIPA缓冲液(Cell Signaling)裂解细胞。

使细胞在冰上裂解10分钟,然后在Bioruptor超声仪(Diagenode)上,以低强度,30秒开/30秒关的循环,进行2分钟超声处理。

通过在4°C下以16000g离心10分钟颗粒化不溶物,并将含有澄清裂解物的上清液用于磁珠 pulldown 。

为了将抗体与磁珠缀合,通过使用磁体,使每个用于免疫沉淀的Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation (Thermo Fisher Scientific) 100μl样品被颗粒化,并除去上清液。

将珠粒重悬于200μl洗涤缓冲液(PBS补充有0.02%Tween 20 (Sigma))中,并加入5μg rabbit anti-Mouse IgG (Sigma M7023)。

在室温下,将样品放在旋转器上,孵化10分钟,以使抗体与珠子缀合。孵化后,用磁铁将珠子颗粒化,除去上清液,并用洗涤缓冲液洗涤珠子两次。

将颗粒重悬于100μl洗涤缓冲液中,并分成两个50μl体积,用于缀合anti-HA antibody (Thermo Fisher Scientific 26183)或IgG抗体对照(Sigma I5381)。

对于每种抗体,向2.5μg抗体中加入200μl洗涤缓冲液,并在室温下,在旋转器上温育10分钟。温育后,使用磁铁颗粒化珠子,并用洗涤缓冲液洗涤两次,并重悬于含有核糖核酸酶抑制剂(Sigma R1158)和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma P8340)的200μl 1×RIPA中。将100微升样品裂解物加入珠子中,并在4℃下旋转过夜。

与样品裂解物一起温育后,颗粒化珠子,用1×RIPA,0.02%Tween 20,洗涤三次,然后用DNase缓冲液(350mM Tris-HCl(pH 6.5);50mM MgCl 2;5mM DTT)洗涤。

将珠粒重悬于DNase缓冲液中,并加入TURBO DNase(Life Technologies)至终浓度为0.08单位/微升。在37℃下,将DNase在旋转器上温育30分钟。

然后通过加入蛋白酶K(New England Biosciences)将蛋白质消化至终浓度为0.1单位/微升,并在37℃下旋转,再孵育30分钟。

为了变性和纯化,加入尿素(Sigma)至终浓度为2.5M,样品孵育30min,使用Direct-Zol RNA miniprep(Zymo Research)纯化RNA。

使用qScript Flex cDNA(Quantabio)将纯化的RNA逆转录成cDNA,并使用Fast Advanced Master Mix和TaqMan qPCR探针(补充表8和9),用qPCR定量pulldown。

所有qPCR反应均以5-μl反应进行,并以384孔格式进行4次技术重复,并使用LightCycler 480 Instrument II进行读数。与其匹配的IgG抗体对照相比,对样品进行富集定量。


CRISPR LwaCas13a蛋白和LwaCas13a NF的易位测量

将HEK293FT细胞接种在聚-d-赖氨酸盖玻片(Corning)上的24孔组织培养板中,并用150ng dLwaCas13a-NF载体和用于ACTB成像的300ng向导转染。对于易位实验,将细胞用4%PFA固定,48小时后用0.2%Triton X-100透化,并使用带有DAPI的抗褪色固定介质(Vectashield)固定。共聚焦显微镜使用的是带有Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD系统的Nikon Eclipse Ti1。

通过测量平均细胞质和核msfGFP荧光,并比较靶向和非靶向条件之间细胞的比率,来分析具有靶向ACTB mRNA向导的dLwaCas13a-NF的核输出。


ACTB转录的FISH

将HEK293FT细胞接种在聚-d-赖氨酸盖玻片(Corning)上的24孔组织培养板中,并用75ng dLwaCas13a-NF载体和用于ACTB成像的250ng向导转染。48小时后,将细胞用4%PFA固定45分钟。使用QuantiGene viewRNA ISH细胞测定试剂盒(Affymetrix)根据生产商的方案在细胞样品上进行FISH。完成FISH程序后,使用防褪色固定介质(Vectashield)固定盖玻片。使用具有Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD系统的Nikon Eclipse Ti1进行共聚焦显微镜检查。


CRISPR LwaCas13a蛋白对应力颗粒的跟踪

将HEK293FT细胞铺在聚-d-赖氨酸盖玻片(Corning)上的24孔组织培养板中,并用75ng dLwaCas13a-NF载体和用于ACTB成像的250ng向导物进行转染。对于应力颗粒实验,在固定和透化细胞之前,使用200μM亚砷酸钠1小时。对于G3BP1的免疫荧光,将细胞用20%山羊血清封闭,并在室温下与anti-G3BP1 primary antibody(Abnova H00010146-B01P)孵育过夜。然后将细胞与用Alexa Fluor 594标记的二抗孵育1小时,并使用具有DAPI(Vectashield)的抗褪色封固剂封固。使用具有Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD系统的Nikon Eclipse Ti1进行共聚焦显微镜检查。

使用Pearson相关系数,使用每个细胞的平均msfGFP和G3BP1信号,计算与dLwaCas13a–NF的应激颗粒共定位。使用Coloc 2插件在图像分析软件FIJI中进行共定位分析。

对于实时成像实验,将HEK293FT细胞铺在96孔组织培养板中,并用150ng dLwaCas13a-NF载体,用于ACTB成像的300ng向导物和5ng G3BP1-RFP报告基因进行转染。48小时后,将细胞置于0μM或400μM亚砷酸钠中,在Opera Phenix高内涵筛选系统(PerkinElmer)上,使用具有20倍水物镜的旋转盘共聚焦设置,每15分钟成像一次,共2小时。将细胞在含有50%CO 2的潮湿室中保持在37℃。使用Opera Phenix Harmony软件(PerkinElmer)测量了活细胞dLwaCas13a–NF与G3BP1–RFP在应激颗粒中的共定位。


Note:

什么是shRNA?

shRNA是英文单词short hairpin RNA的缩写。翻译为“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向重复序列。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列,中间由一茎环(loop)序列分隔的,组成发夹结构,由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。


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