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逆转录RT-PCR实验原理与实战操作指南

作者:Magigen

RT一般有两种含义:

1,最常用的意思:RT,reverse transcription,英文"逆转录"的缩写

2,现在也有人这么解释:RT,RealTime, 英文"实时"的缩写。

这里我们要讲的是逆转录RT-PCR技术。


逆转录RT-PCR原理

什么是逆转录RT-PCR技术?


RT- PCR,英文名为 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,即逆转录PCR,是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。这项技术使用的逆转录酶来自逆转录病毒,是一种能按照碱基互补配对原则,以脱氧核糖核苷酸为底物,以寡居dT为引物,把mRNA转换成相应DNA的酶,由于该酶的效果与中心法则(DNA所承载的生物信息表达顺序应该是DNA-RNA-蛋白)顺序相反,故而有'逆转录'之称。 由于逆转录反应使用了引物和模板,也是聚合酶链式扩增,故称为RT-PCR。


逆转录RT-PCR应用


RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异,细胞中RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA序列(complement DNA)。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术更灵敏,更易于操作。

逆转录RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物,利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,扩增合成目的片段,而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR提取的RNA主要是rRNA,即核糖体RNA,但很少有人用它做些什么,倒是含量较少的mRNA,即信使RNA是中心法则所述的遗传信息表现的中转站,所以我们要把微量的信使RNA弄出来,更重要的是,RNA太容易分解了,环境中无处不在的RNA酶,以及其容易被水解的特点啊,我们不得不尽快把珍贵的信使RNA转化成稳定的形式,于是就有了RT-PCR。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,最关键是:确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

用于反转录的引物,可视实验的具体情况,选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的、不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可选择。


【实验目的】

1.了解用逆转录RT-PCR法获取目的基因的原理。

2. 学习和掌握逆转录 PCR 的技术和方法。

【实验原理】

聚合酶链式反应PCR过程利用模板变性,引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA 序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,是一个指数增长的过程,使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。

一般经过25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。逆转录RT-PCR把以RNA为模板的cDNA合成(即 RNA的反转录)与cDNA 的 PCR 结合在一起,提供了一种基因表达检测、定量和 cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于 cDNA 包括了编码蛋白的完整序列,而且不含内含子,只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究,因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。

首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA,即总 RNA中的 mRNA 在体外被反向转录合成 DNA 拷贝,因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA,称之为互补DNA(cDNA);然后再利用DNA聚合酶,以 cDNA第一链为模板,以四种脱氧核苷三磷酸dNTP为材料,在引物的引导下复制出大量的 cDNA 或目的片段。


在逆转录RT时,有3种引物可选择(表1) 。

1). 随机引物,Random Primers适用于长的、或者具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应
2). Oligo dT Adaptor Primer适用于具有Poly(A)尾端的RNA。由于Oligo dt要结合到Poly(A)尾端上,所以,对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
3). 基因特异性引物,Gene Specific Primer, GSP与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。

表1

用1)和2)方法,理论上是扩增的所有的 cDNA, 还要用此产物做PCR的模板继续扩增。

如果用3)方法,先要去NCBI网站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov查它的序列,并用 oligo等软件设计引物。


逆转录RT-PCR 可以用一步法或两步法的形式进行。两步法 RT-PCR 比较常见, 在使用一个样品检测或克隆多个基因的 mRNA 时比较有用。在两步法RT-PCR中, 每一步都在最佳条件下进行。

cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行 PCR。

而一步法RT-PCR 具有其它优点(表2), cDNA 合成和扩增反应在同一管中进行, 不需要打开管盖和转移, 有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度, 最低可以达到0.1pg 总RNA, 因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR, 一般使用基因特异性引物(GSP)起始 cDNA 的合成。

两步法一步法
起始第一链cDNA合成使用
起始第一链合成使用
Oligo dT,随机六聚体,GSP引物GSP引物
优点优点
灵活方便
引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合
扩增酶的选择转管步骤少,减少污染可能性
困难RT-PCR的优化能力高灵敏度
可以通过选用不同特性的DNA聚合酶和改变反应条件,提高扩增的特异性和忠实性适用于大量样本分析
适用于在单个样品检测或克隆多个基因的mRNA适用于定量PCR

表2

RT酶/逆转录酶/RT-PCR/rt引物选择

图1

由图1可以看出,随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火,产生短的、部分长的cDNA。

这种方法经常用于获取5'末端序列、及从带有二级结构区域、或从带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得 cDNA。

为了获得最长的 cDNA,需要按经验确定每个 RNA样品中引物与 RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng/每20μl 反应体系。

因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA 主要是核糖体RNA,所以模板一般选用Poly(A)+RNA。

Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞 mRNA 3'端所发现的 poly(A)尾杂交。因为 poly(A)+RNA大概占总RNA的1%~2%。

所以与使用随机引物相比,cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性,oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。

建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。

基因特异性引物(GSP)对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷,可以特异性地同RNA目的序列杂交,而不象随机引物或 oligo(dT)那样同所有RNA退火。

用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP 可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同,或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。

已经制备好的双链cDNA和一般的DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中。为此,首先必需有适当的接头(Linker)。接头可以是在 PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段,经PCR扩增后,再克隆入相应的载体,也可以利用末端转移酶,在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC 或 dT和dA 尾巴, 退火后形成重组质粒, 并转化到宿主菌中,进行扩增。


本实验是要从小鼠肝脏组织中获取 Fas配体基因。Fas配体(FasL)是一分子量约为40u的II型跨膜糖蛋白,属TNF家族成员。活化的T细胞可表达Fas和FasL,并通过Fas/FasL系统介导细胞凋亡作用,保持机体免疫系统的自稳态。

近年研究发现,在部分癌细胞中,FasL表达增强,并与肿瘤的复发转移有关。我们采用逆转录RT-PCR方法克隆FasL全长cDNA,并构建其表达载体。这样可以为进一步研究 FasL的功能提供条件。在上下游引物的5'端分别加上了限制酶切位点、及其保护碱基(即 Hind III 和 BamH I),以便可以通过双酶切、将目的片段定向克隆到原核表达载体 pGFPUv上(图2)。

为了便于后续实验,可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白,我们改造了pGFPUv,在其上加了6×His 标签。

逆转录酶/RT酶/RT-PCR/pGFPUv质粒载体结构图

图2. pGFPUv质粒载体结构图


【试剂与器材】

一、试剂

1. 总RNA,或 mRNA

2. RNA酶抑制蛋白RNase Inhibitor:40 U/mL

3. dNTP混合物,各10mM

4. oligo(dT)12-18:2.5mol/L

5. 10*逆转录合成缓冲液(10 RT buffer): 250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3),375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2

6. AMV 逆转录酶: 5u/L

7. 基因特异性5'和3'引物各20mol/L

8. Magigen Taq DNA 聚合酶 5u/L

9. 10*PCR 缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris-Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100, 15mmol/L MgCl2。

二、器材

1. PCR仪

2. PCR管

3. 微量移液器


【操作方法】

一、逆转录

1)逆转录RT反应体系构成:

总RNA或对照RNA0.5~1μg
dNTP混合物2L
oligo(dT)12-181μL
10XRT缓冲液2μL
MagicScript AMV逆转录酶1μL
RNase Inhibitor0.5μL
DEPC水,加至20μL
Total VolumeμL


2)涡旋混匀,42℃反应1小时,95℃加热5分钟,然后置于冰上。

二、PCR扩增

1) PCR反应体系构成

上一步逆转录反应得到的cDNA10L
基因特异性5'和3'引物各1L
dNTP混合物1L
10XPCR缓冲液5μL
Magigen Taq DNA聚合酶0.5μL
DEPC水加至50μL
Total Volume50μL


2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循环

Step195°C变性5分钟
Step295°C变性1分钟
Step355°C复性90秒
Step472°C延伸90秒
Step572°C温育10分钟
Step64°C保存1小时~过夜


Step2-4运行30个循环,其中复性温度主要依据引物的不同而不同。

三、取10-20uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,余下的 PCR产物在-20℃保存。


【RT-PCR注意事项与提示】


1. 逆转录反应过程,需建立无RNAase环境,以避免RNA降解。

2. 成功的逆转录反应决定于高质量的模板RNA。高质量RNA至少应保证全长,并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。

   此外,RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是:RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法,如Trizol Reagent,会减少RNA制备物中沾染的基因组 DNA。

因此在进行PCR反应时,应该对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照反应,以确定扩增出来的片段是来自基因组 DNA,还是 cDNA。

在无逆转录时,所得到的PCR产物来源于基因组。

3. RT-PCR的起始模板可是总RNA或mRNA,都可以检测到扩增结果,如图3。另外,分离mRNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化,从而使信息的检出和定量产生偏差。

然而,当分析稀有基因时,使用mRNA会增加检测的灵敏度。

4. 在逆转录反应中经常加入RNA酶抑制蛋白,以增加cDNA合成的长度和产量。RNA酶抑制蛋白要在第一链合成反应中,在缓冲液和还原剂,如DTT,存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的、可以降解RNA的RNase。RNA 酶抑制蛋白仅防止 RNase A, B, C 对RNA的降解, 并不能防止皮肤上的RNase。

因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心试验者的手上Rnase对样品的污染。

5. 较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开,增加反应的产量。对于多数RNA模板,在没有缓冲液或盐的条件下,将 RNA和引物在65℃保温,然后迅速置于冰上冷却,可以消除大多数二级结构,从而使引物可以结合。

然而某些模板仍然会存在二级结构,即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增,可以使用经过改良的耐高温逆转录酶,如Invitrogen 公司的ThermoScript逆转录酶,使逆转录反应置于较高温度下进行,以改善扩增。

而且适当提高逆转录保温温度, 可增加 RT-PCR的特异性。

6. 建立反应体系时,加完其它反应物后,才加模板DNA和Taq DNA聚合酶,然后将全部反应物涡旋混匀。上PCR仪前,加矿物油封盖或设热盖。

7. PCR 反应的循环数一般25-30次就足够了。过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。

复性温度计算公式:

一般是在引物的Tm值上下浮动。

Tm =2 (A+T) + 4 (G+C) 。

适当提高复性温度可提高 PCR 扩增的特异性。

8. 不管是反转录反应、还是PCR反应,都应先调制试剂的Master Mix (包括 RNase Free dH2O、缓冲液、dNTP Mixture 等),然后分装到每个反应管中。

这样可使所取的试剂的体积更准确,减少试剂的损失,避免重复分取同一试剂,同时也可以减少实验操作造成的误差。而且,分装试剂时务必用新Tip,以防止样品间的污染。

9. AMV、RNase Inhibitor、Taq酶等酶类,要轻轻地混匀,避免起泡。分取之前要轻轻地离心,收集到反应管底部。因其粘度高,所以要慢慢地分取。

酶类务必在实验前,从-20℃取出,使用后立即放回-20℃保存。

10. 最佳的PCR条件因PCR扩增仪的不同而不同。所以在使用样品之前,最好先做Control 反应,以确定最佳的 PCR条件。为延长 PCR仪的使用寿命,应尽可能缩短PCR仪4℃保存的时间,尽量避免4℃过夜的情况。

RT酶/逆转录酶/RT-PCR实验结果与实验分析

图3 逆转录RT-PCR实验结果

Lane 1:总RNA的RT-PCR产物,人细胞调亡因子TF15基因

Lane 2: mRNA 的 RT-PCR 产物,人细胞调亡因子 TF15基因

Lane 3: 100bpmarker

【实验安排】

1. 第一天:试剂的配制、所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase 处理, 0.1%DEPC浸泡或高温干烤。

2. 第二天:进行(一)逆转录和(二)PCR 扩增。

3. 第三天:进行(三)琼脂糖凝胶电泳检测。

4. 为了保证实验质量, 最好能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验这些安排在连续的时间内进行。


【实验报告要求与思考题】

1. RT-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果;

2. 如何提高逆转录RT-PCR 的灵敏度和特异性?


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