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逆转录PCR、RT-PCR实验从入门到精通

作者:Jones

如何进行RT-PCR实验?今天美格君邀请了Jones博士就这个议题,与大家一起探讨。

一、本次RT-PCR实验目的


学习和掌握逆转录、RT-PCR基因扩增技术和操作方法,并深刻理解逆转录、RT-PCR基因扩增技术在功能基因克隆与载体构建过程中的重要性。


二、RT-PCR实验试剂和材料


大肠杆菌DH5a、Trizol试剂、逆转录试剂、PCR相关试剂、PCR产物克隆试剂、氯仿、异丙醇、DEPC水等。

三、实验器材

PCR仪、移液枪、台式低温离心机、恒温水浴锅、恒温培养箱、电泳仪、研钵、紫外分光光度计、移液器和吸头、硅烷化的PCR小管、DNA扩增仪、琼脂糖凝胶电泳所需设备(例如:电泳槽、电泳仪) 、一次性手套。


四、逆转录RT-PCR实验原理


什么是PCR技术?


PCR,polymerasechain reaction,即聚合酶链反应链技术,PCR技术利用耐热DNA聚合酶的反复作用,通过变性-延伸-复性,这个循环操作可以在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍。


PCR技术的特点


1. 高度特异性

2. 高度敏感性

3. 操作简便

4. 适用广泛


PCR三个过程

  1. 变性: 通过加热, 使DNA双螺旋的氢键断裂, 双链解离形成单链DNA。

  2. 退火: 当温度突然降低时, 反应体系中的引物和其互补的DNA(cDNA)模板在局部形成杂交链。

  3. 延伸: 在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸dATP、dCTP、 dTTP、dGTP,以及Mg 2+存在的条件下, 聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。

PCR反应原理

图. PCR反应原理


PCR反应体系构成


成分用量
上下游引物 10-50pmol
缓冲液bufferpH 8.3
Mg2+0.5-2.5mM
dNTPs0.2mM
Taq DNA聚合酶2.5U
DNA模板1ng


PCR反应循环的主要参数

预变性: 92℃-95℃,   2-5分钟

变   性: 92℃-95℃,   30秒-1分钟

复   性: 40℃-60℃,   20--2分钟

延   伸: 70℃-75℃,   30--3分钟

循   环: 30-40次

总延伸: 72℃,   7分钟


PCR引物设计原理


PCR引物长度在15-30bp, GC含量在45-55%之间。

Tm=4(G+C)+2(A+T)

3'端不能与引物内部互补, 以免形成二级结构。两个引物各自的3'端不能互补,以免形成自身扩增。引物必须经过GenBank查询, 证实没有与其他非目的DNA有高度互补以后, 才能使用。

PCR用途


PCR主要用途包括:

1.目的基因的克隆:

   利用特异性引物克隆;利用简并引物克隆

2.基因的体外突变:

   采用随意设计的引物, 在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造

3.基因表达分析

4.DNA的微量分析检测:

   个人识别,亲子鉴定

逆转录PCR, 又称RT-PCR

RT- PCR, ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction, 即逆转录PCR,是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。


RT-PCR原理


RT-PCR提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物, 利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板, 进行PCR扩增,从而获得目的基因或检测基因表达。

首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。

RT-PCR用途

该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。RT-PCR技术灵敏,而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。


逆转录PCR/RT-PCR原因原理图


图. RT-PCR原因原理图

第一链合成

RT-PCR原因原理图, 第一链合成




如何选择反转录酶


1、Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。

2、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。

3、Thermusthermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。

4、MMLV反转录酶的RNase H突变体:商品名为SuperScript 、SuperScriptⅡMagigen MagicScript II、MagicScrpt III。此种酶较其它酶能将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。


四、RT-PCR实验步骤


1、RNA的逆转录

     A. 用1.5ml的离心管混匀下列试剂(TaKaRa公司):

材料用量
OligodT prime 50uM1μl
dNTP 10mM 1μl
total RNA 2-3ug
DEPC水Up to 10μl

     

     B. 在PCR仪进行下列条件的变性, 退火反应

         65 ℃ 5分钟, 冰上急冷

     C. 在上述管中配制下列反转录反应液(Magigen, NEB):

材料用量
5×First Strand buffer4μl
Rasin(40 unit/ ml) 0.5μl
PrimeScript Rtase (200U/μl)1μl
RNase Free dH2O4.5μl
Total20μl


     D.将管子置于42℃水浴中反应1小时。1小时后,在70℃反应10-15分钟,终止反应。放置在-20℃冰箱中保存。

2、PCR

     以逆转录的cDNA为模板,用目的基因引物进行PCR。PCR扩增体系为:

     

成分用量
cDNA 2μl
10X PCR buffer5μl
dNTP (2.5mM) 2μl
primer10.5μl
primer20.5μl
Taq酶0.5U
ddH2O补足到50μl


     扩增条件以引物特性而定。

     PCR条件:

     94℃变性5分钟后开始以下循环

        • 94℃变性反应50秒

        • 58℃退火反应50

        • 72℃延伸反应1分钟

        • 进行24个循环

        • 最后72℃反应7分钟

        • 4 ℃冷却恒定。

   3、电泳检测PCR产物

       采用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量(取10μl扩增产物) 、引物扩增的特异性及长度 。并可根据标准DNA的量,粗略计算   PCR产物的总量。本次实验PCR产物长度:

Os L29-m-PCR( A):340bp:

引物序列L29-m :

up: 5’-TgCgTgTTCgCgCCCTACTT-3’;

low:-5’-gCCACCTgCGTCTTCgCCTg-3’

GCCACCTGCGTCTTCGCCTGCGCCACCTGCACCTGCAGCGTCGCCAGCTGCGGCATCCGTGTGCTAAGT

TAGCTCGCCGGCGAGTGATCGATCGATCGCGAGGGGTTTAAGAATTTGTAATTACCTGCTGCTGCAGCG

CGAAGATGTGGGCGACGCAGCCGTAGACGGGGTCGCGCAGCCTGGCCTGCGCCTCGTAGGTGACGGT

GGCGGCGACCTCGCTCCGGTCGCCCGGCGCCACCTGCTGCAGCAGCTTCGCCGCGTTGCTGGCGCCGA

ACACCTTGTGTATCGCCGCGAACTGCGCCGCCCCGTCCTCCGCGCAGAAGTAGGGCGCGAACACGCA

是 Os L29基因ORF中间一段, 可用于RNAi载体构建


L29-PCR( D) :550bp

引物序列L29 :

up:- 5’- gctgccaatggcgtcgtcggg-3’;

low:-5’-TCATTCCTCCTgCTCgCCgAA-3’

TCATTCCTCCTGCTCGCCGAAGCAGTACATGTCCTGCAGCGACGTCGACCCGTCGGAGCGCGGCGCGC

TGTAGCAGCCGGAGCTCTGCGTCGAGGTCATCGTCGACTCGTGCTCAATCTGCCACGCCTGCTGCTGCT

GCTGCTGATGCTGAAGGAGAGGGTTCCCAGCCGTCAGCATGCCGGCCGCCGCCAGCGTCTGCGCCACC

TGCGTCTTCGCCTGCGCCACCTGCACCTGCAGCGTCGCCAGCTGCTGCTGCAGCGCGAAGATGTGGGC

GACGCAGCCGTAGACGGGGTCGCGCAGCCTGGCCTGCGCCTCGTAGGTGACGGTGGCGGCGACCTCG

CTCCGGTCGCCCGGCGCCACCTGCTGCAGCAGCTTCGCCGCGTTGCTGGCGCCGAACACCTTGTGTATC

GCCACGAACTGCGCCGCCCCGTCCTCCGCGCAGAAGTAGGGCGCGAACACGCACTCCGCCGCGCACTT

GCGCCGCAGGAACTTGCACGCCCCGCACGGCGACCCCGGCACGCCGCCCACTCCCGACGACGCCATTG

GCAGC


PCR实验注意事项:


1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。

2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。

3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。

5.PCR产物中矿物油应尽量吸去,否则会影响提取DNA的产量。


实验后应该思考的问题和经验总结:


1. 降低退火温度对反应有何影响?

2. 延长变性时间对反应有何影响?

3. 循环次数是否越多越好?为何?

4. 如果出现非特异性带, 可能有哪些原因?

建议大家先思考,再参考后面的经验总结。


实验结果

Dl2000



PCR经验总结:


1. 降低退火温度对反应有何影响?


退火温度越高,断开氢键的热能越大,引物与模板越不易结合。反之,退火温度越低,越容易形成氢键,进行退火。 所以当温度高时,只有碱基匹配程度高的,也就是模板与引物形成配对数越多的引物,才能结合到模板上,这样扩增出来的条带最少,甚至只有一条,也就是引物和目的序列的完美匹配,因此特异性越高。反之,若退火温度低,引物和模板匹配低时,也能稳定存在,那么模板上可能存在很多区域能和引物上的少量碱基匹配,进行引发,因此dna条带会很多,非特异带增加。 特异带是指你的目的带。非特异带是pcr中扩增出的非目的带。退火是指温度下降,单链DNA与引物结合的过程。温度过低,可造成引物与模板之间只需有一小段可以互补配对就能配对,造成非特异性产物增加。而温度高时,需要引物与模版之间有较长的互补配对序列才能相互配对,特异性增强。


2. 延长变性时间对反应有何影响?


变性时间延长会导致酶活性的降低。


3. 循环次数是否越多越好?为什么?


虽然,在一定范围内,随着反应循环次数的增加,产物会增多;但超过了一定的次数就不好了。因为再次循环都有高温到低的温度变化,聚合酶的活性有限,而且一般体系中引物和原料的量也不会是无限供应的。随着反应的进行,酶会逐渐失活、dNTP等原料会逐渐消耗掉。

另外循环次数过多,产物间可能会形成较为复杂的结构,影响其作为模板的效率,因此循环次数不是越多越好,一般PCR反应的循环不超过35次。一般设置30-35个循环是比较合适的。


4. 如果出现非特异性带, 可能有哪些原因?


造成非特异性带的原因可能有:

1)、引物设计不合理,出现发夹结构或二聚体;

2)、退火温度不合适;

3)、聚合酶质量不好;

4)、有污染;

5)、引物不纯或过量;

6)、模板过量。


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