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CRISPR Cas9基因编辑原理、敲除机制

作者:Cavanagh & Garrity

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来自塔夫茨大学的Cavanagh和Garrity教授在CRISPR Cas基因编辑方面有很高的造诣。

今天美格君就把Cavanagh和Garrity教授关于CRISPR Cas运行原理、敲除机制的文章整理了一下,大家一起聆听一下大牛们的讲解。

CRISPR Cas9基因编辑原理、敲除机制


CRISPR Cas基因编辑的关键步骤是选择性地靶向特定的DNA序列。CRISPR Cas9蛋白和引导RNA(gRNA)两种生物大分子相互作用形成一种复合物,可以有效的选择性地识别靶序列。

在天然和人工CRISPR/Cas系统中,CRISPR Cas9蛋白负责定位和切割靶DNA。Jinek等人研究发现CRISPR Cas9蛋白有六个结构域,REC I、REC II、Bridge Helix、PAM Interacting、HNH和RuvC(图1)。

RecⅠ结构域是最大的,负责与RNA结合。RECⅡ域的作用尚不清楚。富含精氨酸的Bridge Helix对于启动目标DNA结合时的切割活动至关重要。PAM Interacting域赋予PAM特异性,负责启动与靶DNA的结合。

HNH和RuvC结构域是切割单链DNA的核酸酶结构域。它们与其他蛋白质中发现的HNH和RuvC结构域高度同源。

crispr cas9蛋白基因编辑原理机制

图1. CRISPR   Cas9蛋白结构域。CRISPR Cas9蛋白由六个结构域组成。晶体结构、图示来自PDB文件:   4CMP


如果没有向导RNA,CRISPR Cas9蛋白保持无活性。

在工程化的CRISPR Cas9系统中,向导RNA由单链RNA组成,形成由一个四碱基环tetraloop和两个或三个茎环stem loops组成的T形结构(图2).向导RNA经过工程化后,具有与靶DNA序列互补的5'末端。

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图2:工程化导RNA。工程化导RNA是单链RNA。它形成一个四碱基环和两个或三个茎环(本图显示了三个)。目标区域显示为红色。(图像来自PDB:4UN3 )

 

这种人工向导RNA与CRISPR Cas9蛋白结合,结合后诱导蛋白质构象变化(图3)。构象的改变将不活跃的蛋白质转化为活性形式。构象变化的机制尚不完全清楚,但Jinek及其同事假设CRISPR Cas9蛋白质侧链和RNA碱基之间的空间相互作用或弱结合可能会导致这种变化。

crispr cas9蛋白基因编辑原理机制

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图3:通过与向导RNA结合来激活CRISPR Cas9蛋白。向导RNA的结合诱导CRISPR Cas9蛋白的构象改变。构象变化导致CRISPR Cas9核酸酶活性激活。(图像来自PDB:4UN3)

一旦CRISPR Cas9蛋白被激活,它就会通过与原间隔基序PAM序列匹配的序列结合,随机搜索目标DNA。PAM是一个两碱基或三碱基序列,位于与向导RNA互补的区域的一个核苷酸下游。PAMs已在所有CRISPR Cas系统中被鉴定,定义PAM的特定核苷酸特异于CRISPR cas系统的特定类别。化脓性链球菌中的PAM为5′-NGG-3′结构。当CRISPR Cas9蛋白找到具有适当PAM的潜在靶序列时,该Cas9蛋白将熔化PAM上游的碱基,并将其与向导RNA上的互补区配对。如果互补区和靶区正确配对,RuvC和HNH核酸酶域将在PAM上游第三个核苷酸碱基之后切割靶DNA(图4)。

cas9-principle4A.jpgcas9-principle4B.jpg


图4. CRISPR Cas9蛋白结合和切割靶DNA。

1) CRISPR Cas9蛋白扫描可能的目标DNA,寻找合适的PAM(黄色星星)。

2) 当CRISPR Cas9蛋白质找到PAM时,蛋白质和向导RNA复合物将熔化PAM上游的碱基,并将它们与向导RNA上的目标互补区配对。

3) 如果互补区和靶区配对正确,RuvC和HNH结构域将在PAM上游第三个碱基之后切割靶DNA。(图像,PDB:4UN3 渲染的左下和右下;从PDB:4CMP渲染的左上)


This article is adapted from Cavanagh & Garrity, “CRISPR Mechanism”, CRISPR/Cas9, Tufts University


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