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CRISPR Cas12a的切割原理一

作者:thomas

大家好,我是托马斯,应美格君的邀请,今天想讲一下crispr cas12a的切割原理。CRISPR Cas12a在最近的快速检测应用中崭露头角。那么crispr cas12a是怎样工作的呢?

CRISPR Cas12a切割原理

大家都已经非常熟悉crispr Cas9这个强大的基因组编辑工具,但其除了crispr cas9这个基因编辑工具以外,还有一些非常出色的Cas核酸酶编辑工具。V型crispr cas12a蛋白,以前称为Cpf1,就是一个很好的例子。尽管crispr cas12a蛋白的开发比Cas9蛋白晚了几年,但是crispr Cas12a蛋白有一些特别的优势,可用于某些特定的应用。crispr Cas12a最常用的变体之一是来自Acidaminococcussp.BV3L6的酶,AsCas12a蛋白。与crispr Cas9蛋白一样,Cas12a蛋白目前已被广泛应用于包括细菌、酵母、植物和人类细胞在内的许多物种。

crispr cas12a作为一种2类核酸酶,是一种向导RNA引导的双链dna(dsDNA)断裂的多结构域蛋白。与crispr   cas9蛋白一样,crispr cas12a蛋白结构可细分为REC和NUC叶(图A)。

crispr cas12a蛋白切割原理--cas12a蛋白结构域

图A. crispr cas12a蛋白域结构

crispr cas12a蛋白的NUC叶缺少HNH结构域,但含有RuvC结构域,用于DNA切割。此外,NUC叶有一个楔形结构域和一个“核酸酶”(NUC)结构域,这两个结构域不能切割DNA。crispr AsCas12a蛋白有1307个氨基酸长,几乎和crispr SpCas9蛋白一样大。

与crispr cas9蛋白不同,crispr cas12a蛋白不需要tracrRNA进行pre-crRNA加工,也不需要RNaseIII。然而,其他V型核酸酶,例如CRISPRCas12b蛋白,确实需要tracrRNACRISPR Cas12aWED结构域中具有核糖核酸酶位点,其允许将pre-crRNA自主形成成熟的crRNACRISPR Cas12acrRNA明显短于CRISPR Cas9向RNAsgRNAcrRNA++tracrRNA)。概括的来说,这允许紧凑的Cas12a CRISPR阵列,可用于同时靶向多个位点。一旦与CRISPR Cas12a蛋白结合,crRNA的重复衍生部分就采用5'伪结构。在crRNA的间隔区衍生部分内,PAM近端(种子)区域通过与蛋白质的相互作用,预先排序,暴露这些核苷酸,用于与DNA靶链的碱基配对相互作用。

crispr cas12a蛋白切割原理

图B crispr cas12a切割原理图



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