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全新的CRISPR位点特异性微生物基因编辑技术ET-seq

作者:Magigen

大多数微生物生活在微生物群落中,对基因突变和表型结果进行观察是破译微生物基因功能的主要手段。

这种经典的基因研究方法需要对物种进行隔离,这有许多的局限性。

传统的微生物基因编辑方法的缺点:

1. 绝大多数微生物都没有在实验室中分离出来,因此在很大程度上不受分子遗传学的影响。

2. 参与微生物之间相互作用的基因大部分仍未被研究。

3. 单独生长和研究的微生物会迅速适应实验室环境,掩盖了它们的“野生型”生理机能。

由于大多数与环境、工业和健康相关的微生物生活在社区中,因此开发可以在社区环境中进行的精确基因组编辑的方法具有革命意义。

最近由美国加利福尼亚大学伯克利分校研究人员Rubin等人组成的一个团队研发了一种全新的CRISPR微生物基因编辑系统,无需对微生物进行分离,大幅提高了微生物基因编辑的效率。


全新的CRISPR微生物基因编辑技术


这种新的微生物基因编辑方法叫做应用环境转化测序ET-seq方法,Environmental Transformation sequencing,是一种用于编辑微生物群落中特定生物体基因组的通用策略,用于确定微生物群落中那些易于核酸传递和基因组编辑的微生物物种,其中非靶向转座子的插入在传递到微生物群落后,被映射和量化,以识别遗传易处理的成分。

ET-seq确定共轭和电穿孔是合成土壤群落中有效的传递途径。

接下来,研究人员构建了DNA编辑、一体式RNA引导的CRISPR–Cas转座酶(DART)系统,该系统与传输方法以及ET-seq兼容,将目标DNA插入经过ET-seq鉴定为可处理的生物体中,可以在社区环境中实现生物体和位点特异性基因操作。

转座子包含条形码,在无需选择的情况下,可以对CRISPR–Cas引导的转座子进入易控制的微生物基因组(由ET seq确定)的效果进行评估。

研究人员利用土壤和婴儿肠道微生物群,结合使用ET-seq和DART系统,对几种细菌进行物种和位点特异性编辑,测量非模型细菌的基因适合度,并丰富目标物种。这些工具可以很方便的编辑微生物群落。

微生物基因编辑技术ET-seq


图1. 微生物基因编辑技术与ET-seq                                                                                               Nature, Rubin et al.

a、 ET seq提供了多种递送方法(包括接合、电穿孔和自然DNA转化)对微生物群落成员的插入效率的数据。在这个示例中,蓝色菌株最适合电穿孔(黄色星号)。这些数据允许确定可行的目标和DART目标编辑的交付方法。

b、 ET seq测定了已知数量的插入的、预编辑的K.michiganensis的效率。实线表示线性回归对不为零的数据的拟合(n = 11个独立样本;R2 = 0.89,最小二乘法线性回归)。

c、 ET seq测定了合成土壤群落(n = 3个生物重复)。每个生物的平均相对丰度在括号里表示(合成土壤群落的组合).



ET-seq 识别可遗传的细菌

在复杂的微生物组中编辑生物需要了解哪些成员可以进行核酸递送和编辑。ET-seq系统可以用来评估微生物群落中单个物种获取和整合外源DNA 的能力(图1a)。在 ET-seq 中,微生物群落暴露于随机整合的移动遗传元件(此处为mariner转座子),并且在没有任何选择的情况下,使用两种协议提取和测序总群落 DNA。后续对插入事件和相对丰度的测序构成了一个指标的基础,该指标综合了关于传递方法(接合、电穿孔或自然转化)、插入效率和传递后突变存活率的信息。

首先,研究人员对插入的DNA 和宿主 DNA 之间的连接点进行富集和测序,以确定每个宿主中的插入位置和数量(扩展数据图1a和方法)。

在第二个协议中,研究人员使用低深度 (~0.3-Gb) 宏基因组测序来量化样本中每个社区成员的丰度。

如果之前未对社区进行过测序,则在此步骤中需要进行高深度宏基因组测序 (~10 Gb), 以提供参考基因组和丰度信息。

总之,这些测序程序为微生物群成员提供了相对插入效率。


为了将这种相对测量值转换为与已知插入效率相关的测量值,研究人员将这些数据标准化为内标,将相同数量的内标添加到每个样品中。ET-seq 的最终读数估计了每个生物体在提取DNA时携带转座子插入的比例,这是递送、插入效率和递送后突变体存活的综合指标(扩展数据图1b)。基于内部标准和宏基因组丰度的插入和标准化的生物信息量化产生了一种特定于物种的遗传可及性度量,即特定微生物组中获得转座子插入的成员的百分比 。

为了促进这些不同数据的整合,该团队还开发了一个完整的生物信息学管道,用于根据内部标准和宏基因组丰度对插入进行量化和标准化(https://github.com/SDmetagenomics/ETsuite and Methods)。

总之,ET-seq 的实验和生物信息学方法通过测量获得转座子插入的给定微生物组的每个成员的百分比来揭示物种特异性的遗传可及性。


研究小组通过向一个由9名成员组成的合成土壤群落中添加已知数量的经编辑的克雷伯氏菌来验证他们的方法。

团队设计了针对两个特定于K. michiganensis的基因组区域的引导RNA,然后通过共轭将DART系统传递给微生物群落;

ET-seq显示条形码转座子在正确的位点插入。此外,对合成土壤群落中基因组编辑的跟踪,使该团队能够量化相关突变的适应效应。

研究人员还将ET-seq和DART应用于体外培养的婴儿肠道微生物群,对几个菌株进行了物种和位点特异性编辑。

此外,通过使用DART系统,使用菌株特异性引导RNA,将抗生素标记物传递到微生物群落,然后选择转座子,研究人员能够分离目标生物体。

CRISPR基因编辑技术研发机构Magigen的专家David将这项新的微生物基因编辑技术与传统的基因编辑方式进行了比较,认为该新技术是一次很大的飞跃。

实验表明,ET-seq能够量化仅发生在0.001%细胞中的基因插入。


参考文献

Species- and site-specific genome editing in complex bacterial communities

Benjamin E. Rubin, Spencer Diamond, Brady F. Cress, Alexander Crits-Christoph, Yue Clare Lou, Adair L. Borges, Haridha Shivram, Christine He, Michael Xu, Zeyi Zhou, Sara J. Smith, Rachel Rovinsky, Dylan C. J. Smock, Kimberly Tang, Trenton K. Owens, Netravathi Krishnappa, Rohan Sachdeva, Rodolphe Barrangou, Adam M. Deutschbauer, Jillian F. Banfield & Jennifer A. Doudna


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