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基于CRISPR Cas13a的快速、简易核酸检测CREST

作者:Maxwell Z. Wilson

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对于COVID19新冠病毒核酸检测,很少有端到端的解决方案能够在不牺牲灵敏度的前提下满足快速可扩展性和低成本的要求。这里,美格君介绍一个由美国加利福尼亚大学Maxwell Z. Wilson博士团队开发的一种基于CRISPR Cas13a蛋白的SARS-CoV-2 RNA检测方法,该方法成本低,灵敏度高,易于在基础设施最少的地点部署。

基于CRISPR Cas12蛋白和CRISPR Cas13蛋白方法在病原体检测方面具有革命性。他们是敏感的,目前结合恒温扩增方法和横向流动免疫层析检测,已使在POCT场景使用。这些方法对于COVID-19的检测是很有前途的。然而,由于全球对检测的需求,这些协议中的关键试剂很难获得。为了降低COVID-19诊断的障碍,Wilson博士团队设计了一种称为CREST的方法(基于CRISPR Cas13a的、坚固的、公平的、可扩展的检测,英文Cas13-based, Rugged, Equitable, Scalable Testing)。CREST通过利用通用的酶、低成本的热循环设备和易于使用的荧光可视化仪,解决了限制那些基于CRIPSR Cas13检测的三个主要障碍,试剂可获得性、设备可用性和成本。此外,CREST在灵敏度上与金标准逆转录定量PCR(RT-qPCR)方法相当,RT-qPCR最常用于COVID-19检测。

方法和结果

为了设计一种灵敏、低成本、易用的SARS-CoV-2检测方法,研究人员首先确定了实验的关键步骤,这些步骤需要稀缺的试剂、特定设备和训练有素的人员来执行,从而对在基础设施和资源有限的场所进行检测造成了障碍。

对于基于CRISPR-Cas13蛋白的方法,这些步骤包括

(i)在检测前扩增目标样本

(ii)通过比色法(免疫层析)或荧光法显示Cas13活性。

为了降低第一道屏障,研究人员分析了酶被放大后,检测特定SARS-CoV-2基因组序列的有哪些可选择的手段(图1)。

CRISPR CAS13A蛋白,taq酶,低成本快速核酸检测系统

图1. 基于CRISPR Cas13蛋白的检测方法和CREST修正综述。

i-iii. 标准样品采集、RNA提取和反转录。

iv. 使用大众化的Taq聚合酶和便携式热循环器而不是等温反应进行扩增。

v. 转录和CRISPR Cas13a蛋白激活后,用蓝色LED(∼495 nm)和橙色滤光片或其他荧光检测系统对去猝灭的裂解报告子进行荧光检测。


金标准方法依赖于RT-qPCR。定量检测是通过使用专门的仪器,检测荧光探针来完成的,荧光探针实时报告目标序列的扩增程度。虽然灵敏度很高(约为每微升几十个目标分子),但主要限制是需要实时热循环仪、分析软件和经过培训的人员进行数据解释。撇开局限性不谈,通过PCR扩增目标核酸序列的技术核心是稳健和敏感,并利用广泛使用的Taq聚合酶。

这些优点促使研究人员将PCR与基于CRISPR Cas的病毒序列检测方法相结合,这是一种利用CRISPR Cas9蛋白成功检测DNA序列的方法。PCR所需的热循环器是昂贵的专用仪器,通常仅限于专业实验室。然而,最近兴起的“自己动手组装生物学”(DIYbio)运动通过创建价格合理的、支持蓝牙的、可现场使用的热循环器(甚至可以由电池供电),使PCR成为可能。这些多功能的热循环器可以在非传统环境中使用,在中等温度下的性能与传统的热循环器一样好。这些设备,例如mini-PCR mini16,为病毒目标材料的扩增提供了一种低成本的解决方案,并且可以使COVID-19检测,广泛可用(图2)。

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图2. 用CREST检测新冠病毒RNA

A. 采用mini-PCR-mini16热循环仪和P51分子荧光可视化仪。两者都是便携式的,可以用电池操作,并且占地面积最小。

B. 使用P51可视化仪对N1、N2和N3合成靶标进行荧光可视化。


为了减少第二个障碍,即测试结果的可视化,研究人员探索了检测CRISPR Cas13蛋白活性的方法。当CRISPR Cas13a蛋白与靶结合时,它催化RNAa的非特异性裂解。这种靶特异性识别可通过多种方式检测,例如,通过侧流免疫层析或通过使用荧光素和猝灭剂结合的poly(U)RNA裂解报告器的荧光可视化。侧流试纸条是一种很有前途的检测方法。这些试纸条带利用毛细管作用,使分析物通过带有抗体条带的固体支撑材料移动,从而产生二进制读数。虽然它们易于使用和读取,但它们目前的可用性是有限的,相对于每次测试的成本而言,它们是昂贵的(图3B)。因此,研究人员找到一种价格合理、可扩展、易于解释的解决方案,以实现可视化。在CREST方案中,使用了P51纸板荧光可视化仪,由9伏电池供电,用于检测CRISPR Cas13a蛋白活性(图2)。

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图3.

方法敏感性和每次试验试剂成本的对比分析。

(A) (左)使用定量荧光检测仪器比较方法灵敏度。(右)RT-PCR+Cas13检测, 用横向流动条显示。

(B) 每种测试方法、每次测试的相关试剂成本(不包括前期仪器成本)。一个测试被定义为一个样本,一式三份。

为了验证这些设备的简化工作流程,研究人员测量到了与CDC RT-qPCR检测相对应的三种病毒序列的存在。简言之,用PAGE纯化退火合成DNA寡核苷酸,其两侧是上游T7 RNA聚合酶启动子,其编码对应于SARS-CoV-2核衣壳基因中N1、N2和N3位点的序列。接下来,研究人员在体外转录DNA以获得靶标RNA。对CRISPR Cas13a蛋白纯化和反应条件的广泛优化之后,用这些靶点来确定CREST方案的检测限,并发现每μl可以检测到10个拷贝的靶RNA分子(图2B)。这一结果表明CREST的灵敏度与对应的RT-qPCR相当,证明了CREST将热循环扩增步骤(PCR)与线性扩增步骤(转录)相结合,并通过荧光检测进行酶信号扩增的能力。

接下来,研究人员定量比较了CREST的灵敏度和成本与现有方法的灵敏度和成本。首先,将其与RT-qPCR(一步TaqMan分析)进行了比较,发现尽管CREST的试剂具有类似的敏感性,但即使在中试实验的低规模下,其成本也低于RT-qPCR(图3)。此外,CREST仪器的前期成本要低30到50倍。其次,我们比较了CREST的RT-PCR扩增步骤和基于Cas13的利用RT重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)的方案。我们发现热循环放大(20个循环),在放大反应时间可比的情况下,更有效(图3A)。此外,与RPA所需试剂的专有、高成本、相对较小的批量生产率形成鲜明对比的是,Taq聚合酶,它已经大量生产了几十年,是现代分子生物学的主力,在室温下容易获得和稳定,并显著降低了成本(图3B)。最后,科研人员比较了横向流动测试试纸条可视化和CREST,虽然发现它们与荧光检测方法一样敏感(图3A),但它们的高成本和难以获得限制了它们在本次新冠病毒大流行中的分布和规模使用。

为了测试CREST对人体样本的有效性,研究人员从圣巴巴拉县公共卫生局收集的个体中获得了64个去鉴定的鼻咽拭子。用市售的RNA提取试剂盒,从这些样本中纯化RNA,并将其储存在病毒运输介质中。将此RNA作为CREST和CDC推荐的一步TaqMan分析的平行比较的输入。将CREST-to-TaqMan与sigmoid进行比较。然后计算了检测N1、N2和RNase P的试验之间的拟合优度R值。这些分析揭示了CREST和TaqMan分析之间的高度一致性(SARS-CoV-2基因的R2>0.9,RNA酶P的R2>0.79)。值得注意的是,CREST对N1的检测似乎比TaqMan更敏感,而对N2的检测则相反。研究人员进行了两个额外的比较,一个是在加利福尼亚大学圣巴巴拉分校(UCSB)进行口咽自我取样的95名无症状个体,另一个是从加利福尼亚大学旧金山分校(UCSF)获得的30名阳性和30名阴性NP/OP样本。综合起来,结果显示CREST的敏感性为97%,特异性为98%。


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参考文献

A Scalable, Easy-to-Deploy Protocol for Cas13-Based Detection of SARS-CoV-2 Genetic Material




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