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CRISPR Cas13a结合恒温扩增技术进行病毒检测与实战验证

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利用恒温扩增和CRISPR Cas蛋白酶对报告分子的附带裂解功能进行病毒核酸检测是定量PCR的一种很有前途的替代方法。

有几种不需要特殊仪器的RNA检测技术,包括逆转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RDA、RPA)和逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)。

RT-RDA、RPA和RT-LAMP是高度敏感的方法,但在等温条件下会出现非特异性扩增,导致用于RNA病毒检测时出现假阳性结果。

通过加入额外的序列特异性检测模块,例如基于杂交的荧光寡核苷酸探针,可以提高这些恒温扩增方法检测的准确性。

基于CRISPR Cas的诊断检测方法,使用RNA引导的CRISPR Cas12蛋白/Cas13蛋白核酸酶探针的附带切割活性,通常与RT-LAMP或RT-RDA等温扩增方法结合使用。

RT-LAMP或RT-RDA的引物可以针对特定的病毒RNA序列设计,并且在Cas酶检测步骤之前使用扩增方法,来倍增来自特定核酸序列的检测信号。

由于核酸扩增步骤和CRISPR-Cas病毒检测步骤都需要序列特异性来触发信号扩增,CRISPR Cas病毒诊断方法具有高度敏感性和高度特异性。

Cas13蛋白介导的核酸探针裂解的读数可以通过荧光检测或使用侧流条法来完成;后者的优势在于条带便于携带,结果可以通过目测读取,并且可以通过智能手机轻松量化。与基于杂交的检测方法相比,基于CRISPR Cas13的检测可以在同一容器中进行,同时进行恒温扩增,大大简化了检测时的操作程序,降低了污染风险。

然而,在操作的简单性会牺牲测试性能:更容易操作的一步法CRISPR诊断的敏感性低于两步法,即先执行扩增,然后进行CRISPR介导的检测步骤。

来自泰国VISTEC科学技术研究所的 Chayasith Uttamapinant 博士团队利用CRISPR Cas13a和恒温扩增技术,开发了一套针对新冠病毒COVID19的快速检测方法,并在实战中进行了验证。

这份研究报告是基于CRISPR Cas13a蛋白夏洛克SHERLOCK系统对SARS-CoV-2病毒RNA的敏感和特异检测的临床验证。研究人员对534份临床样本进行了SHERLOCK夏洛克检测。他们首先描述了154个临床样本(其中81个SARS-CoV-2阳性)的检测特征,然后在实际诊断环境中对另外380个临床样本进行了术前评估。用具有不同Ct值(11-37)的临床样本、以及无症状病例的样本来检测该方法。

研究团队发现SARS-CoV-2 RNA的SHERLOCK病毒检测系统的特异性为100%,荧光读数的灵敏度为96%,横向流读数的灵敏度为88%。这些特征与其他POCT基因检测的准确性和性能相当,但对专用仪器没有要求。在该方法的特征检测限LoD范围内(每个反应大约42个拷贝,对应于33.5的Ct),SHERLOCK对荧光读数具有100%的特异性和100%的灵敏度,对侧流读数具有97%的灵敏度。为了便于在资源有限、核糖核酸酶(RNase)污染风险增加的检测环境中使用SHERLOCK,他们设计了侧向流检测,以包含核糖核酸酶污染的内部控制,并证明了在单个侧向流条中多重检测SARS-CoV-2 RNA和核糖核酸酶的存在。

结果

SARS-CoV-2的SHERLOCK检测依赖于RT–RPA等温扩增相关的病毒基因片段,然后是CRISPR–Cas介导的扩增基因检测。在本研究中,使用的是LwaCas13a蛋白。

CRISPR–Cas检测扩增的基因序列触发报告分子的附带裂解切割,用于荧光或横向流动测量(图1)。

crispr cas13a和恒温扩增技术检测病毒

图1.


研究人员首先设计并测试了总共四对RPA引物和相应的CRISPR RNA(crRNAs),它们靶向SARS-CoV-2的spike(S)、Nucleoprotein(N)和Replicase polyprotein 1ab(Orf1ab)基因。

其中两对引物和crRNAs针对S和Orf1ab基因,先前已经用合成RNA进行了验证。另外两对引物和靶向N基因和Orf1ab的另一个区域的crRNAs, 被设计用于匹配用于SARS-CoV-2检测的标准RT-qPCR分析中的基因区域。所有的RPA引物和crRNA序列都被设计为对SARS-CoV-2病毒RNA具有特异性和选择性,并最小化对其他常见人类冠状病毒的靶外亲和力。

检测限和特异性分析

Chayasith团队首先对所选的四个基因区域使用不同的RPA引物和crRNAs组合来确定基于SHERLOCK的SARS-CoV-2检测的LoD。

研究人员使用在Vero细胞中培养的SARS-CoV-2中提取的总RNA作为LoD标准,对提取的RNA进行连续稀释,并用RT-qPCR测定其对应的Ct值,以确保获得临床相关Ct范围。

他们发现在横向流动条带和荧光读数下,S基因的检测是最敏感的,可重复检测到稀释10-6样本,对应于RT-qPCR分析中约33.5的Ct和每个反应约42个拷贝,通过设备digital-droplet PCR定量。

N基因检测的低灵敏度可能是由于设计的N 基因的RPA扩增子较长;事实上,将N基因的RPA反应时间延长到1小时可提高检测灵敏度。

基于SHERLOCK的SARS-CoV-2临床检测方法的验证

在使用S基因作为靶序列评估SHERLOCK的性能之后,研究人员在COVID-19临床样本上进行了基于SHERLOCK的SARS-CoV-2检测,并直接对照标准RT-qPCR检测对SHERLOCK检测性能进行了基准测试。

为了最大限度地减少患者选择偏差,并确保该验证研究反映了COVID-19阳性患者Ct值的完整分布,研究人员纳入了从Siriraj医院获得的所有可用阳性样本。

为了尽量减少信息偏差,在将阳性和阴性样本交给研究人员之前,将其随机分组,并在不了解RT-qPCR结果的情况下解释SHERLOCK结果。

由于RT-qPCR是在SHERLOCK之前对所有样本进行的(研究人员使用RT-qPCR的剩余RNA进行SHERLOCK验证),研究人员将RNA样本储存在−80°C以减少降解,并始终在Siriraj医院现场进行SHERLOCK验证实验,以消除运输过程中样本降解的可能性。

对总共154份临床样本进行了验证研究,包括81份经RT–qPCR验证的COVID-19阳性样本(N基因的Ct范围为11–37)和73份经RT–qPCR验证的COVID-19阴性样本。

在154个临床样本中,能够通过荧光和侧流条读数识别所有73个阴性COVID-19样本,通过荧光读数识别81个阳性COVID-19样本中的78个,通过侧流条读数识别81个阳性COVID-19样本中的71个。Ct值小于32的样品都可通过荧光和侧向流读数检测到,与从培养的病毒RNA中确定的LoD Ct(33.5)非常匹配。

除此LoD外,还观察到使用荧光读数的检测灵敏度更好,样本Ct值可检测高达37,尽管信噪比要低得多。用横向流动检测Ct值大于32的样品不太可靠,这可能是因为需要临界浓度的切割RNA报告子来积累足够的纳米金粒子,以便在测试线上产生可观察到的比色信号。

由于并非所有的高Ct值样本都能被SHERLOCK方法检测到,这可能是在低水平的目标RNA时,RPA的扩增可能会发生变化,初始RNA输入需要足够高的浓度,以确保有效的扩增和检测。因此,研究人员对RPA步骤进行了进一步的经验优化,发现加倍RPA反应组分可以提高低病毒样品的检测灵敏度。

与RT–qPCR相比,基于SHERLOCK的检测临床样本中SARS-CoV-2的S基因的荧光读数法具有96%的敏感性和100%的特异性,而横向流读数法具有88%的敏感性和100%的特异性。

SARS-CoV-2 RNA的多重SHERLOCK检测与RNase酶污染侧流条检测

由于SHERLOCK是基于核酸检测的,活性核酸酶的存在,尤其是核糖核酸酶RNase的存在,可能会模糊检测结果。核糖核酸酶RNase可导致RNA输入降解,导致假阴性,或者如果带入到CRISPR–Cas检测步骤,可切割RNA报告子并产生假阳性。

目前的SHERLOCK方案包括RNase抑制剂和灭活核酸酶的步骤,以及一个阴性对照,以确保没有导致假阳性结果的污染(和一个阳性对照以确保成分的功能性)。

研究人员将内部核糖核酸酶RNase污染检测纳入基于SHERLOCK的核糖核酸酶检测的设计中。

由于LwaCas13a显示其附带活性的序列偏好,他们设计了一种对Cas13a切割具有抗性、但仍然对RNase I-、RNase A-和RNase T1介导的切割敏感的RNase反应性RNA报告子(图2a)。

RNA报告器被地高辛DIG和荧光素功能化,允许用抗DIG抗体在横向流动条上捕获,并用与纳米金粒子(抗Fl–NP)结合的抗荧光素进行检测。

将DIG-荧光素功能化的RNase reporter、生物素-荧光素功能化的LwaCas13a reporter和能够检测DIG-和生物素相关分析物的侧流条结合一起,可以实现一个管检测,同时检测SHERLOCK的目标RNA和RNase酶污染。

这种多重读出应该能够很容易地区分真阳性结果和核糖核酸酶污染引起的假阳性结果。

对SARS-CoV-2 RNA系列稀释液的分析表明,与单一检测相比,复合检测保持了SARS-CoV-2s基因检测的敏感性(图2d)。

crispr cas13a和恒温扩增技术检测病毒

图2.


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