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BiFC检测内质网与线粒体的相关性

作者:Mandy Jackson & Paul Skehel来源:Nature

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内质网膜和线粒体外膜之间的紧密接触促进细胞器之间脂质的有效转移,并协调Ca2+信号转导和应激反应。

这种耦合的变化与许多代谢紊乱和神经退行性疾病有关,包括阿尔茨海默病、帕金森病和运动神经元病。

在靠近的区域两膜之间的距离低于常规光学显微镜的分辨率,这使得分析这些相互作用充满挑战性。


研究人员利用双荧光互补bifc蛋白技术标记了固定细胞和活细胞中ER线粒体结合的子集。

通过BiFC方法检测到的ER线粒体结合的总数随着丝裂霉素诱导的ER应激、血清剥夺或有丝分裂素2(MFN2)水平的降低而增加。

这种方法将有助于分析ER和线粒体膜之间的动态相互作用。

最初通过超微结构分析,识别了线粒体外膜(OMM)和内质网(ER)之间的紧密联系的区域,随后发现了促进协调Ca2+转移和两者之间信号的特殊结构。

ER膜的这些区域被生物化学纯化为线粒体结合膜,或“MAM”,并显示出富含一系列蛋白质,包括负责脂质合成和两个膜系统之间转移的酶。

mtDNA合成和线粒体分裂似乎在与ER紧密邻接的部位上协调一致,自噬体的形成也是如此。

ER线粒体连接的性质被牵连在许多病理学中。

与MAM相关的代谢活性在阿尔茨海默病中增加,表达P301L tau的转基因小鼠似乎具有更多的与线粒体相关的ER膜。

在家族性帕金森氏症中,DJ-1的缺失降低了ER-线粒体联系,破坏了线粒体Ca2+稳态,α-突触核蛋白被定位于MAM。

ER蛋白VAPB和线粒体PTPIP51/RMDN3之间的相互作用,通过对TDP43活性敏感的机,影响这些细胞器中Ca2+水平的偶联,从而将ER -线粒体相互作用与自发和家族形式的肌萎缩联系起来。

此外,通过ER-线粒体接触的代谢稳态信号转导在代谢性疾病中具有核心作用。

在固定细胞中用电子显微镜测量的ER和OMM之间紧密对合的距离在5-30nm之间不等,ER所覆盖的线粒体区域的范围取决于细胞类型和代谢活性。

通过针对分离膜的荧光信号的共定位分析,已经检测和量化了膜关联,但是空间分辨率受限于150-200 nm,因此不能区分不同距离的ER/OMM接触。

基于固定细胞中的邻近连接、荧光素酶互补和活细胞中的二聚体依赖性荧光蛋白(ddFP)方法,已经成功地开发了检测和定量ER线粒体结合的替代方法。

科学家人员利用双分子荧光互补BiFC系统进行研究,其中两个互补的荧光蛋白片段在ER或线粒体上表达。

当这些细胞器的膜非常接近时,荧光蛋白的两个互补片段可以结合和重建功能性荧光蛋白。只有当OM和细胞质表面的ER紧密贴合时,才会产生BIFC信号。

因此,该方法以比共定位更高的分辨率和比ddFP更低的背景来提供结构信息。与ddFP一样,这种方法可以很容易地应用于实时跟踪活细胞内膜并置的动态和分布。

此外,由于互补片段只能在直接相互作用时产生荧光,而不能单独产生荧光,因此与BiFC接触的细胞器定量对局部蛋白浓度变化的敏感性的要求要低于ddFP方法。


为了生成用于ER和OMM紧密结合的BiFC报告物,研究人员将YFP Venus蛋白的两个互补片段分别靶向ER和OMM。

原则上,功能YFP只在两个膜足够接近的区域生成,以便两个互补的Venus片段直接相互作用。

通过融合小鼠VAPB蛋白的全长或C端25个氨基酸,将N端片段Venus靶向ER膜的细胞质表面,分别产生V1-VAPB和V1-ER。

通过与TOMM20的前34个氨基酸融合,将C端片段Venus 2靶向于线粒体外膜,产生V2-Mito。

限制靶向序列的大小确保仅检测到膜的最密切关联。

这些融合蛋白在细胞系NSC34中的亚细胞定位是通过免疫细胞化学分析、用抗GFP的多克隆抗血清确定的,GFP识别Venus蛋白的N端和C端片段(图1)。

20181006A1.jpg图一


来自V1-VAPB的免疫荧光信号与共同表达的ER标记ER-DsRed2(Clontech)共定位,但不与线粒体蛋白ATPB共定位(图1A和表1)。

类似地,V1-ER也与ER标记共定位,但不与线粒体蛋白ATPB定位(图1B)。

相反,V2 MITO与ATPB定位,但不与共表达的ER DSReD2(图1C)共定位。

在NSC34细胞中,V1-VAB或V1-ER与V2 MITO的共同表达产生容易检测的BiCF信号(图2)。

20181006B1.jpg

图二

V1-VAPB/V2-Mito几乎在所有线粒体周围产生荧光图案,类似于靶向ER和OMM27的二聚体依赖性荧光蛋白所报告的荧光图案。

短V1-融合蛋白V1-ER与V2-Mito共同表达产生具有离散的荧光点与线粒体亚群相关的明显荧光信号(图2)。

这些信号似乎只存在于ER和线粒体紧密贴合的区域,分别通过ERp72和ATPB的免疫标记显示(图2)。V1-VAPB、V1-ER或V2 MITO的表达单独产生YFP信号(图S1)。

V1-ER与V2-Mito共表达48小时后,NSC34、COS7或HEK293细胞中ER或线粒体形态无明显变化(图2)。V2-ER与V2 Mito BiFC进一步的特征还有待研究。


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参考文献

A Bi-fluorescence complementation system to detect associations between the Endoplasmic reticulum and mitochondria

Mark Harmon, Philip Larkman, Giles Hardingham, Mandy Jackson & Paul Skehel






文章分类: 行业-蛋白质
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