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用BiFC工具发现蛋白质CDK5-p25之间相互作用的新的小分子抑制剂

作者:Ralf Thoma  and Imre Berger来源:ncbi

广州美格生物专业提供BiFC技术服务BioID技术服务CRISPR Cas蛋白。欢迎来电咨询。


蛋白质-蛋白质相互作用PPI是基因表达、蛋白质易位、细胞周期进程和信号转导等最基本的细胞机制的核心。

细胞蛋白质组通常由大的、稳定的和短暂的复合体组成,在人类中可以包含十个或更多的亚基,通过大量的PPI来稳定。

在原生细胞环境中表征这些相互作用,并遵循它们的动态组装和拆卸,是理解细胞机制及其在疾病状态中的功能障碍的重要先决条件。

研究体细胞环境中的PPI有一些很好的方法,包括荧光共振能量转移FRET、双杂交系统、生物发光共振能量转移BRET、蛋白质片段互补分析和双分子荧光互补BiFC

在BiFC中,两个被认为相互作用的蛋白质或结构域分别与分裂的荧光报告蛋白的C-末端和N-末端一半融合。

一旦形成相互作用体之间的PPI,报告的两个分割部分可以重新组装,从而恢复荧光团,从而产生可检测的荧光信号。

重组不会自发地发生,但只有当相关的蛋白质或域确实相互作用时才发生。

与其他PPI分析方法,特别是FRET相比,BiFC不需要事先了解所研究的复杂体的三维结构,或者要求事后采集处理图像,用于数据解释。

此外,由于荧光蛋白的强荧光,BiFC依然可以通过简单的荧光显微镜,在低表达水平,对PPI提供直接的可视化手段。

另一方面,FRET可以实时检测复杂的联合和分离,而荧光团在BiFC分析中是不可逆的,排除了对分离动态的检测。

最近发展的用于检测PPI的纳米荧光素酶技术NanoBiT,荧光素酶两个分裂部分,与相互作用物融合。

与其他技术相比,BiFC的优点在于,它不需要可能产生毒性或干扰细胞功能和代谢的外源试剂。

BiFC成功地应用于在一系列细胞模型中可视化的蛋白质相互作用。此外,BiFC在评估小分子对高通量筛选HTS中蛋白质复合物形成的影响方面特别有用。


为了利用BiFC进行有效的基于细胞的PPI筛选分析,我们在单个细胞中生成了两个基因。

如果要研究复杂的多组分集合,则需要表达更多的用于相互作用的编码基因。

此外,在实验中测定的每个细胞中个体表达水平必须是同样理想的。


我们将MultiBacMam,一个基于杆状病毒的哺乳动物基因传递工具,与BiFC结合,形成了一套高效的PPI调节剂分析开发、鉴定与表征系统。

MuldiBaMaM是基于我们最初的MultiBac杆状病毒,这是我们已经开发的用于昆虫细胞中的多蛋白复合物生产。

MuldiBaMaM的特点是非常大的重组DNA负荷容量,高哺乳动物细胞转导率,低毒性,安全的处理,并提供调节蛋白质表达水平的病毒剂量。

MuldiBaMaM可以有效地应用于广泛的哺乳动物细胞系。

我们使用我们的MultiBacMam BiFC工具包来分析PPKI之间的CDK5激酶和P25。

CDK5是一种细胞周期素依赖性激酶,参与神经元的发育和维持神经元结构和神经变性。

其失调与多种神经退行性疾病有关,如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血和肌萎缩性侧索硬化。CDK5活性依赖于其激活剂p35和p39的结合。

钙蛋白酶裂解p35,产生p25,它与CDK5结合,修饰复合物的细胞定位,高度激活CDK5并改变其基质的识别。

这些修饰与神经毒性有关,因此与神经退行性疾病有关。CDK5-P25 PPI是一个极具吸引力的药物靶点。

然而,据我们所知,目前明显缺乏以哺乳动物细胞为基础的成功的筛选策略。

在体外和体内描述的第一个特异性CDK5抑制剂是P520 - 23,它代表p35的肽片段。

它显示了抑制CDK5-P25 PPI,并从诱导的细胞凋亡中拯救皮层神经元。

为了建立有效的BiFC分析方法,有必要对诱饵蛋白和猎物蛋白的不同组合进行测试,并在它们的N末端或C末端与荧光蛋白片段融合。

对于每一个BIFC测定,一个相互作用对可以形成8个可能的组合。

我们基于MultiMam系统(表1)为BiFC建立了一套质粒试剂,包括编码分裂荧光团部分的DNA。


Constructs tagged at N-termConstructs tagged at C-term
pACEMam1-VenNt-GOIpACEMam1-GOI-VenNt
pACEMam1-VenCt-GOIpACEMam1-GOI-VenCt
pACEMam1-mCherry-GOIpACEMam1-GOI-mCherry
pACEMam1-eGFP-GOIpACEMam1-GOI-eGFP
pMDCP-VenNt-GOIpMDCP-GOI-VenNt
pMDCP-VenCt-GOIpMDCP-GOI-VenCt
pMDCP-eGFP-GOIpMDCP-GOI-eGFP

表一



利益相关的蛋白质可以通过选择的方法(常规克隆、不依赖序列和连接的克隆方法)插入,从而引起N-末端(Nt)或C-末端(Ct)融合。

CDK5和p25分别与质粒模块pACEMam1和pMCDP中分离的Venus荧光团VN(氨基酸1-154)或VC(氨基酸155-258)(图1a)的片段融合。

在MultiMam系统中,通过Cre-LoxP融合将单个质粒模块重组,确保所有转染细胞中,以规定的比例表达所有选择的蛋白质,产生均匀的细胞群。

将Cre融合质粒转染COS7细胞,检测BiFC不同组合的效率。

当CDK5和p25都标记在它们的N-末端(数据未显示)上时,阳性细胞数(即产生可检测荧光信号的细胞)和荧光强度达到最高。

CDK5-P25相互作用可通过染色体凝集引起细胞死亡。

为了防止在转染的细胞群体中普遍的细胞死亡,引入了CDK5催化结构域(D144N)的突变。

与转染后16小时野生型相比,CDK5D144N证明细胞毒性较低(图1b)。基于这些结果,我们选择分离Venus与CDK5D144N和p25的N端融合的构建用于下面描述的实验

20180928A.jpg

图1

MultiBacMam基因传递工具

为了扩大我们的BiFC工具应用范围,扩展到几乎每个哺乳动物细胞模型,包括难于质粒转染的细胞系,我们接着开发了MultiBacMam基因传递工具,一种改良的杆状病毒,

这来源于我们最初的MultiBac杆状病毒/昆虫细胞表达系统。

杆状病毒已被证明有效地转染,但不在哺乳动物细胞中复制。

我们早些时候已经构建了MultiBac杆状病毒基因组,通过从基因组中去除有害功能,来优化昆虫细胞中的多蛋白表达。

我们的MultiBacMam杆状病毒保留了这些优点,包括延迟细胞裂解和减少蛋白水解,从而在受感染的昆虫细胞中产生高质量的杆状病毒。

我们通过 整合包含水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因编码的表达盒来修饰MultiBac基因组,该基因被证明可以增强哺乳动物细胞的转导。

此外,我们共同整合了杆状病毒启动子驱动的mCherry荧光蛋白表达盒,以便通过观察红色来监测感染昆虫细胞培养物中的病毒扩增(图2a)。

pACEMam衍生的BiFC质粒模块包含短DNA序列(Tn7L和Tn7R),用于T7转座酶介导整合到存在于MultibacMam杆状病毒基因组上的 mini-attn7 附着位点(图2a)。

20180928B.jpg

图2

通过Tn7转位到在大肠杆菌细胞(DH10MultiBacMam)中的MultiBacMam基因组(图2a),将含有功能性VN-CDK5(D144N)/VC-p25 BiFC对的融合构建体整合,

保留病毒基因组作为细菌人工染色体和产生Tn7转座酶的辅助质粒。选择阳性克隆,并根据已建立的协议产生重组杆状病毒。

然后在昆虫细胞中产生的复合MultiBacMam杆状病毒转导U2OS、HeLa和Cos7细胞系,其多重感染(MOI)范围在25-500之间。

在所有测试的细胞系中观察到BiFc信号。在HeLa和COS7中,需要200的MOI来可视化相互作用。

相比之下,在U2OS中,在50MOI时已经可以观察到BiFC,尽管在500MOI时可以获得更大比例的阳性细胞和更高的荧光强度(数据未示出)。

使用MultiBacMam的转导率和表达水平显著高于基于质粒的转染(图2b)。

我们还观察到MultiBacMam早期诱导外源结构的表达,从而使我们能够在一天内进行转导和检测。

我们进行了时间历程分析,以确定最佳的测定动力学。

在转导后20小时期间进行延时扫描,监测阳性细胞数量和Venus强度值。

转导后七~八小时达到最大阳性细胞数。我们观察到的阳性细胞比例的减少可能归因于CDK5D144N-p25相互作用触发的残留细胞毒性,尽管使用了突变体。

Venus强度值持续增加,可能是由于分裂荧光团不可逆的重建。我们在表达后16小时对平板进行扫描,此时观察到最大数量的阳性细胞和高水平的强度。


我们在这里报告了第一种基于哺乳动物的细胞检测,它整合了BiFC、我们的MultiMam和MultiBacMam杆状病毒,用于高效基因递送。

该工具箱可用于质粒转染、杆状病毒介导的转导,以及通过使用同一组试剂在广泛的细胞模型中稳定地产生细胞系。

我们将MultiBacMam BiFC工具包应用到CDK5-p25交互作用对,从而首次建立了在体内类似原生细胞的环境中针对这种交互作用的筛选,其设置是可扩展的,如果需要的话,可以达到真正的HTS。

在我们的研究中,我们发现三种化合物,有效地消除了我们分析的CDK5-P25 PPI。


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参考文献

MultiBacMam Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) tool-kit identifies new small-molecule inhibitors of the CDK5-p25 protein-protein interaction (PPI)

Itxaso Bellón-Echeverría, Jean-Philippe Carralot, Andrea Araujo Del Rosario, Stephanie Kueng, Harald Mauser, Georg Schmid, Ralf Thoma and Imre Berger




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