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什么是CRISPR Cas14蛋白?

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CRISPR Cas14是一个非常紧凑的RNA引导核酸酶家族。尽管CRISPR Cas14蛋白的体积很小,但它们能够靶向单链DNA(ssDNA)进行切割而不需要限制性的序列要求。此外,CRISPR-Cas14蛋白对靶点的识别触发了单链dna分子的非特异性切割,这种活性可以实现高保真单核苷酸多态性基因分型(Cas14-DETECTR)。宏基因组测序数据显示,多个CRISPR-Cas14蛋白系统独立进化,提示单效应CRISPR适应性免疫的潜在进化起源。

CPRISPR Cas14蛋白是如何发现的?

这非常偶然。

CRISPR Cas14蛋白是由Harrington和David Burstein在加州大学伯克利分校同事过去15年创建的微生物基因组数据库中寻找Cas变体时发现的。这个庞大的基因组数据库是通过对来自各种外部环境样本的DNA进行宏基因组测序获得的。CRISPR/Cas14蛋白是在从科罗拉多州一个有毒清理点采集的地下水样本中测序的古细菌基因组中发现的。


“我们偶然发现了这些非常小的Cas蛋白质,其他人只是把它们扔掉,因为它们看起来不像以前已知的CRISPR系统。它们太小了,” Harrington对美格君说。“管他的,我们决定试一试。我们对它进行了测试,发现它们是真正的功能系统,我们感到非常震惊。”

CRISPR Cas14的结构和功能

在第2类CRISPR-Cas系统中,一个100-200kda的CRISPR Cas蛋白具有多个功能域,执行RNA引导的DNA或RNA底物的结合和切割。为了确定在自然界中是否存在更简单、更小的RNA引导蛋白,Harrington查询了庞大的宏基因组数据集,以寻找靠近CRISPR阵列和cas1的非特征化基因。他们分析确定了CRISPR-Cas系统的一个不同家族,该家族包含cas1、cas2、cas4和一个先前未被识别的cas14蛋白,该基因编码40-70kDa多肽。在比较序列分析的基础上,研究人员初步确定了24种不同的crispr cas14蛋白基因变体,这些变体分为三个亚组,Cas14a蛋白、Cas14b蛋白和cas14c蛋白。crispr cas14蛋白大小约400到700个氨基酸(aa),大约是先前已知的第2类CRISPR RNA引导酶(950到1400 aa)的一半大小。尽管已鉴定的crispr cas14蛋白表现出相当大的序列多样性,但所有的crisprcas14蛋白都通过RuvC核酸酶结构域的存在而结合在一起,其组织结构是V型CRISPR Cas DNA靶向酶的特征(图1)。

crispr cas14蛋白只存在于古细菌中,而不存在于细菌中。因此,这个基因可能比Cas蛋白的另一个版本crispr cas9蛋白和crispr cas12蛋白更原始。

在一项研究中,crispr cas14基因与CRISPR阵列一起被克隆, 并在大肠杆菌中表达。在细菌中,crispr cas14蛋白可以结合并随后切割一个特定的单链DNA,类似于cas13蛋白和cas12蛋白。然而,这种切割比cas12蛋白或cas13蛋白更具特异性,因为它需要一个特定的gRNA序列才能发挥作用。

研究还表明,虽然crispr cas9蛋白需要PAM序列,但Cas14蛋白没有这种要求。

Cas14蛋白的进化可能是为了抵御单链DNA病毒或那些可通过单链中间结构传播的可移动基因元素。

CRISPR Cas14蛋白的优点、用途   

随着CRISPR Cas14蛋白的加入,人们现在可以检测到双链DNA、单链DNA和RNA。此外,Cas14蛋白的特异性增加了单核苷酸多态性SNP的保真度。

CRISPR-Cas14蛋白很可能最终将用于多个研究领域,如病毒和微生物感染的诊断,以及癌细胞的检测和修饰。研究表明,这个系统在富含单链DNA病毒的生态系统中可能特别有效。

crispr cas14蛋白结构图

图1. CRISPR Cas13结构图




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