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如何设置CRISPR Cas13a与恒温扩增检测反应体系

作者:Jonathan

广州美格生物提供全系列的CRISPR Cas蛋白、恒温扩增试剂、逆转录酶、侧向层析试纸条,用于基因编辑、快速检测。想了解详情,请点击:CRISPR Cas蛋白恒温扩增试剂逆转录酶侧向层析试纸条


重要提示:本方案以张锋实验室的CRISPR Cas13a检测方案为参考,只用于科学研究,不可以用于临床。


CRISPR Cas13a与恒温扩增反应体系设置

A. 概述述

新型冠状病毒COVID-19可以通过qPCR进行诊断,但由于试剂和设备昂贵,疾病检测速度比较慢。为了提高COVID-19的诊断水平,我们在此介绍了一种基于张锋CRISPR的SHERLOCK技术与恒温扩增RDA技术结合,检测COVID-19的方法。利用人工合成的COVID-19病毒RNA片段,能够在20-200aM范围内(每微升输入10-100个拷贝),检测到COVID-19靶序列。该测试可以从患者样本中纯化的RNA开始进行,就像用于qRT PCR分析的一样,可以在不到一小时内用试纸读出,而不需要精密仪器。

SHERLOCK COVID-19检测方案分三步工作,像qRT-PCR一样,从核酸提取开始,可在1小时内完成。


实验步骤


1–25分钟孵育使用重组酶聚合酶扩增(Magigen RDA or TwistDx RPA)试剂盒恒温扩增提取核酸样品;

2孵育30分钟使用CRISPR Cas13检测预扩增的病毒RNA序列;

(3)–2分钟孵育–使用Magigen CRISPR产物侧向层析试纸条目测读出检测结果。

以下部分详细介绍了所需的试剂以及步骤。


B、实验要求

为了检测标本核酸提取液中是否存在COVID-19病毒RNA,在COVID-19基因组的S基因和Orf1ab基因中选择两个靶点。设计RPA扩增引物和LwaCas13a蛋白CRISPR向导RNA进行特异性检测。为了最大限度地提高检测的特异性,要对靶标序列进行选择,最小化脱靶效应。

利用合成COVID-19S基因和Orf1ab基因RNA片段, 连续稀释,能够检测到每微升10-100个拷贝的合成COVID-19病毒RNA序列。下面是不同输入浓度的侧向层析试纸条读数的示例图像:

CRISPR Cas13a蛋白与恒温扩增反应体系配置

C.材料和试剂

样本和核酸提取:

应根据适当的生物安全程序采集患者样本。本实验使用的CRISPR Cas13蛋白和恒温扩增试剂,大家可以采购市面上的商品,例如TwistDX, Magigen,NEB,IDT,ThermoFisher赛默飞等产品。

从步骤(1)开始,该方案的输入可以是与qRT-PCR分析中使用的相同的提取核酸。

试剂:

对于步骤(1)等温放大:

- TwistAmp® Basic (TABAS03KIT), TwistDx or Magigen RDA-Basic

- ProtoScript® II Reverse Transcriptase(M0368L), NEB or Magicscript Reverse Transcriptase (RTase) II,逆转录酶,RT酶

- RPA Amplification primer pairtargeting S gene (S-RPA-Forward_v1:

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA-3’; S-RPA-Reverse_v1:

5’-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’), 可以从IDT或者Magigen购买

-靶向Orf1ab的RPA扩增引物对 (Orf1ab-RPA-Forward_v1:

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACC-3’; Orf1ab-RPA-Reverse_v1:

5’-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3’)


对于步骤(2),使用CRISPR Cas13蛋白检测病毒RNA

-切割缓冲液(400mM Tris pH 7.4 in ddH2O). 预制,可采用1M Tris pH 7.4 stock solution from SigmaAldrich (T2194-100ML)

- SUPERase•In™ RNase Inhibitor (AM2694),ThermoFisher Scientific

- NxGen® T7 RNA Polymerase (30223-1),Lucigen

- Ribonucleotide Solution Set (N0450S),NEB

- Magnesium chloride solution (63069-100ML),Sigma Aldrich

- Storage Buffer for diluting Cas13protein stock (combine 2.5 mL of 1M Tris pH 7.4, 6 mL of 5M NaCl, 2.5 mL ofglycerol, and 100 μL of 1M DTT, and 38.9 mL ddH2O)

- 纯化CRISPR LwaCas13a蛋白 accordingto Kellner et al., Nature Protocols 2019, stored as 4ul aliquots at 2mg/mL. 可采用Magigen Cas13a蛋白。

- CRISPR LwaCas13a crRNA for detecting S gene(S-crRNA_v1:

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3’), 可以从Magigen或者Synthego购买

- CRISPR LwaCas13a crRNA for detecting Orf1ab gene(Orf1ab-crRNA_v1:

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUUUUUAAACUAU-3’)

- Reporter RNA for lateral flow read out(Lateral-Flow-Reporter:

5’-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3’)

For Step (3) reading out using lateral flowdipstick:

- HybriDetect Dipstick (MGHD 1), MileniaBiotec GmbH Positive control sequences (can be produced using T7 transcription from synthesized DNA oligos):

- S gene fragment:

5’-UAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUUCUAUUAAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUUACAGAUGCUGUAGACUGUGC-3’

- Orf1ab gene fragment:

5’-UGAGUGUAAUGUGAAAACUACCGAAGUUGUAGGAGACAUUAUACUUAAACCAGCAAAUAAUAGUUUAAAAAUUACAGAAGAGGUUGGCCACACAGAUCUAAUGGCUGCUUAUGUAGACAAUUCUAGUCUUACUAUUAAGAAACCUAAUGAAUUAUCUAG-3’

设备:

-37°C水浴锅

-42°C水浴锅

-用于旋转1.5mL试管的微型离心机


D、实验方案

***重要提示:为防止样品污染混淆检测结果,应使用两个不同的工作区域执行步骤(1)和(2)。

步骤(1)应在预扩增区域进行,对污染特别敏感。放大后的样品不应在步骤(1)的工作区域打开。设立一个单独的区域用于扩增后反应,用于执行方案的步骤(2)。孵育后,步骤(1)的反应只能在扩增后区域打开。

另外,仅在扩增后区域中进行步骤(3)的反应。

***重要提示:在指定温度孵育前,所有反应要在冰上进行。

步骤(1-等温扩增,在扩增前工作区域进行:

为了测试每个样品,设置两个RPA反应,分别用于检测S基因靶标和Orf1ab靶标。另外,可以使用合成的病毒片段建立S基因和Orf1ab的阳性对照。还应设置未添加测试样品的阴性对照。

使用RPA试剂盒中提供的29.5ul Rehydration再水化缓冲液重悬每个冻干的RPA沉淀。

对于S基因靶标,每个反应可以设置如下:

1. Resuspended RPA solution      5.9 ul

2. S-RPA-Forward_v1 (10 uM)      0.5 ul

3. S-RPA-Reverse_v1 (10 uM)      0.5 ul

4. ProtoScript RT (100,000U/mL)   0.2 ul

5. ddH2O                                       1.4 ul

6. Sample                                      1 ul

7. MgAc (supplied in RPA kit)    0.5 ul

Total                                            10 ul


对于Orf1ab基因靶标,每个反应可以设置如下:

1.Resuspended RPA solution          5.9 ul

2.Orf1ab-RPA-Forward_v1 (10 uM) 0.5 ul

3.Orf1ab-RPA-Reverse_v1 (10 uM) 0.5 ul

4.ProtoScript RT (100,000U/mL)      0.2 ul

5.ddH2O                                           1.4 ul

6.Sample                                             1 ul

7.MgAc (supplied in RPA kit)            0.5 ul

Total                                                   10 ul

充分混合,并在预热的42水浴锅中孵育每个反应25分钟。温育后,立即将反应物放回冰上,直到准备好,添加到步骤(2)的反应中。


步骤(2-使用Cas13检测病毒RNA序列

取一份等份的CRISPR LwaCas13a蛋白2mg/mL4ul),用122.5ul储存缓冲液重悬。

对于每个S基因RPA反应,按照如下要求建立CRISPR-Cas13检测反应:

1.Cleavage Buffer (400mM Tris pH 7.4)   2 ul

2.ddH2O                                               9.6 ul

3.LwaCas13a蛋白 (resuspended)      2 ul

4.S-crRNA_v1 (10 ng/ul)                         1 ul

5.Lateral-Flow-Reporter (20 uM)             1 ul

6.SUPERase•In RNase Inhibitor             1 ul

7.Lucigen T7 Polymerase                    0.6 ul

8.Ribonucleotide Solution                    0.8 ul

9.MgCl2 (120mM)                                   1 ul

10.RPA reaction from Step (1)                1 ul

Total                                                      20 ul

对于每个Orf1ab基因RPA反应,按下列条件建立CRISPR-Cas13检测反应:

1. Cleavage Buffer (400mM Tris pH 7.4)   2 ul

2. ddH2O                                                9.6 ul

3. LwaCas13a protein (resuspended)       2 ul

4. Orf1ab-crRNA_v1 (10 ng/ul)                1 ul

5. Lateral-Flow-Reporter (20 uM)           1 ul

6. SUPERase•In RNase Inhibitor              1 ul

7. Lucigen T7 Polymerase                     0.6 ul

8. Ribonucleotide Solution                   0.8 ul

9. MgCl2 (120mM)                                  1 ul

10. RPA reaction from Step (1)               1 ul

Total                                                      20 ul

设置好所有反应后,摇晃充分混合,在离心机中旋转,并在预热37℃水浴锅中培养30分钟。孵育后,将反应管放回冰上,继续进行步骤(3),读取侧向层析试纸条结果。


步骤(3)–通过侧向层析试纸条目视读出检测结果

步骤(2)后,向每个20ul反应中加入80ul HybriDetect测定缓冲液,并充分混合。将稀释的反应物置于室温的管架中。

HybriDetect检测试纸条放入每个反应管中,等待反应流过试纸。

阳性对照样品应显示两行,阴性对照样品应仅显示底线。

对于每个测试样品,检查S和Orf1ab基因是否都出现两条线,如果是,就表明COVID-19阳性结果。


E. 实验说明

   本文提供的参数、说明仅供参考,实验人员可以根据自己的需要调整材料、配置,实现自己的目标。


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