TEL   :020-34438810     18027152056
Email:  info@magigen.com

LAMP扩增技术、CAS蛋白、基因分型检测、逆转录酶、CDMO服务


美格生物
MAGIGEN
最新文章
生物技术及产业新闻

用CRISPR Cas12a进行快速新冠病毒检测

作者:Guanghui Tang来源:Nature

广州美格生物提供全系列的CRISPR Cas蛋白,用于基因编辑、快速检测。想了解详情,请点击:CRISPR Cas蛋白


如何利用CRISPR Cas蛋白开发快速检测产品系列4

1. 选择恒温扩增体系。常用的有RDA、RPA、LAMP恒温扩增方法。

2. 选择合适的CRISPR Cas蛋白。

3. 确定目标基因序列。例如新冠病毒COVID19的O基因和N基因。

4. 配置反应体系。

5. 逐级稀释样本,测试灵敏度。

6. 优化反应体系,提高反应灵敏度。

CRISPRCas系统在序列特异性RNA分子的引导下识别和降解外源核酸。一些Cas酶如Cas12a酶Cas12b酶Cas13a酶Cas13b酶Cas14‍酶在结合特定靶点后显示出附带切割活性,可以用于检测核酸的诊断用途。在靶识别时,激活的Cas核酸酶无差别地切割附近的单链DNAssDNA)。通过引入荧光团和猝灭标记的ssDNAreporter报告分子或荧光团和生物素标记的ssDNA reporter报告分子,可以用荧光读取器或侧流试纸条检测。

虽然所有这些蛋白都是RNA引导的核酸酶,但Cas13a蛋白Cas13b蛋白RNA酶,而Cas12a蛋白Cas12b蛋白Cas14蛋白DNA酶。因此,基于Cas13aCas13b的检测需要RNA聚合酶的转录步骤,相反,Cas12a蛋白Cas12b蛋白Cas14蛋白可以直接使用DNA作为底物。为了提高检测灵敏度,通常需要用等温法或PCR法对核酸进行预扩增。通过结合RDA, RPA重组酶聚合酶扩增技术,Cas12aCas13a可以在给定的反应中进行分子检测。

在这项研究中,我们提出了一种用CRISPR-Cas12a系统检测SARS-CoV-2ORF1abN基因的方法。通过RPA技术与Cas12a的检测相结合,使用荧光阅读器或通过肉眼在50分钟内获得检测结果(图1A)。

20210312A.jpg

1基于Cas12aSARS-CoV-2检测工作流程。

用提取的RNA或裂解的样本可作为RPA Cas12a检测的输入。

a)使用荧光阅读器或其他可视检测方法,可以在50分钟内看到结果。

b RNA提取或快速样品裂解后进行分析所需的最少设备,包括紫外线成像仪、加热块(42°C37°C)、移液管和吸头、Eppendorf管、试剂和侧流条、CRISPR相关cas蛋白、RPA重组酶聚合酶扩增;RT酶,室温;SARS-CoV-2严重急性呼吸综合征冠状病毒2型;UV紫外线。


由于寡核苷酸序列对于快速且敏感的RPA是至关重要的,因此需要筛选引物以建立优选的检测方法。我们分别测试了18个和15ORF1abN的靶基因引物组合,每个反应使用100个拷贝的RNA。为了筛选出ORF1ab基因的最佳引物组,用一对反向引物(R2)对正向引物(F1F5)进行筛选,选出最佳正向引物(F5),然后用它筛选所有的反向引物(R1R5)。鉴定出性能最好的引物对,并在随后的实验中使用(F5+R1,图2A-2D)。SARS-CoV-2N基因引物采用相同的程序,F4+R2引物组表现出最好的性能(图2E-2H)。

20210312B.jpg

2引物筛选。

用单个正向或反向引物与相应的反向或正向引物对ORF1aba–d)和Ne–h)引物进行筛选,选出性能最好的引物,然后用其进行第二轮筛选,以确定性能最好的引物对。

Cas12a反应在10min获得荧光信号。

为确定该系统的分析灵敏度,将靶点依次稀释至110100拷贝/μL。然后从每个稀释产物中取1μLRNA为模板,进行3个独立重复,每个重复做5个技术重复。

CRISPR cas12aORF1abN基因的分析都能够在所有分析稀释液中检测到相应的靶点,并且在非模板对照中没有显示任何信号。这些结果说明我们开发的CRISPR-Cas12a分析达到单拷贝敏感性。

然后,我们将引物与其他冠状病毒基因组进行调整比对,发现序列与大多数病毒序列不相似。

此外,靶向SARS-CoV-2ORF1abN基因的crRNAs与其他冠状病毒有一些不匹配,这表明该分析对靶点的高度特异性,因为crRNAs已被证明对单核苷酸突变敏感。

我们进一步实验评估了我们的检测方法对4株人冠状病毒和11种呼吸道病原体的特异性。SARS-CoV-2与受试呼吸道病原体之间未观察到交叉反应。这些结果共同证明所建立的系统对SARS-CoV-2具有高度的特异性。

我们测试了各种样本裂解方案,发现使用Triton X-100Tween -20、盐酸胍,附带加热步骤的方案产生最强的信号。然当取消加热步骤时,信号显著降低,这意味着在没有加热的情况下样品不完全溶解。该方案使样品处理在5分钟内完成,未提取的裂解液可直接作为RT-RPA扩增的模板。

可视检测对于核酸诊断至关重要。

我们开发了一个在5′端标记FAM分子和在3′端标记生物素的报告分子。当与横向流动条结合时,肉眼可见报告分子的消灭。该方法显示模板的分析灵敏度为1拷贝/μL


接下来,我们比较了RPA结合CRISPR-Cas12a的方法与仅RPA的方法的灵敏度,后者似乎不如前者敏感,在侧流分析中,ORF1abN基因的观察检测限(LoD)值分别为50拷贝/μL10拷贝/μL在荧光检测试验中,在给定的反应中,仅RPA检测的灵敏度也低于基于Cas12a的检测,ORF1abN基因的LoD分别为1000100拷贝。这一观察结果可能归因于Cas12a的附带活性诱导的信号放大效应。因此,可以合理地推测,基于CRISPR-Cas12a酶的检测方法通常比仅使用RPA的系统更敏感。


返回首页


参考文献

Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a

Dan Xiong ,Wenjun Dai ,Jiaojiao Gong ,Guande Li,Nansong Liu,Wei Wu,Jiaqiang Pan,Chen Chen,Yingzhen Jiao,Huina Deng,Junwei Ye,Xuanxuan Zhang,Huiling Huang,Qianyun Li,Liang Xue ,Xiuming Zhang ,Guanghui Tang


相关阅读

CRISPR Cas12a的切割原理一

CRISPR Cas12a切割原理二   

CRISPR Cas12a蛋白和CRISPRCas12b蛋白有何不同?   

iSCAN, RT-LAMP+Cas12b新冠病毒检测系统

利用CRISPR–Cas12b进行高效的植物基因工程编辑

G-triplex-CRISPR-Cas12a,一种全新、灵敏的快速检测方法   

G-triplex: A new type of CRISPR-Cas12a reporter enabling highly sensitive nucleic acid detection


会员登录
登录
我的资料
我的收藏
留言
回到顶部