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CRISPR诊断技术正带来一场变革

在CRISPR技术推出的早期,主要是用于基因编辑。但是随着SHERLOCK、DETECTR快速检测技术的推出,CRISPR技术开始在快速检测领域崭露头角。随着这些技术的不断升级、完善,检测水平、检测灵敏度已经逼近传统的PCR检测技术,一场检测技术的革命即将到来。今天,美格君就和大家一起看看,CRISPR是如何改变医学诊断的。

以往,CRISPR给人们的印象了是一种基因编辑技术。但是,它已经用于诊断多种疾病。大家都知道crispr cas蛋白,也叫cas酶。Crispr cas9蛋白常用于基因编辑技术。而目前,crirsprcas9蛋白、cas12蛋白、cas13蛋白、cas14蛋白已经被人们利用,成功开发出全新的CRISPR快速检测技术,可以诊断传染性疾病,如寨卡病毒,以及涉及核酸的非传染性疾病,如癌症。

让我们看看几种常见的CRISPR Cas蛋白酶在疾病诊断方面的实际应用。


一、CRISPR-Cas9蛋白诊断检测方法

CRISPR Cas9蛋白已经应用于疾病诊断。被用于诊断的cas9蛋白有两种,有酶活性的Cas9蛋白,无核酸酶活性的dead Cas9蛋白(dCas9蛋白)。

  1. 活性cas9蛋白

    将具有催化活性的Cas9用于疾病诊断的方法分为两类:样品制备和检测

    在样品制备中使用Cas9蛋白

    Cas9蛋白被用于一种被称为FLASH(通过杂交发现低丰度序列)的诊断方法的制备步骤。“杂交”是指Cas9核糖核蛋白中的crisprRNA(crRNA)与靶DNA“杂交”。在FLASH中,cas9蛋白的目标不是一个位点,而是利用大量的配套crRNA, 对应上百个位点。

    这些crRNA被设计成靶向Cas9,将病原体的基因组DNA分解成大小合适的片段,用于下一代测序(NGS)。然后进行扩增子测序,这样就可以检测大量的基因序列,例如抗生素抗性基因。

    在诊断检测中使用Cas9的方法。

    NASBA-CRISPR裂解(NASBACC)方法是在检测中使用活性Cas9蛋白系统的一个案例。这种方法方便携带、成本低。它可以区分美洲和非洲寨卡病毒株,它们的基因组在原间隔基序PAM位点上只有1个碱基的差异。这种方法涉及到RNA的逆转录和RDA恒温扩增技术,这一过程被称为基于核酸序列的扩增(NASBA),产生足够的双链DNA,dsDNA, 被Cas9蛋白切割。根据DNA序列的不同,如果存在要找的PAM位点,dsDNA被切割; 如果PAM位点不同,有改变,dsDNA将不被切割。在NASBA扩增反应过程中,不仅DNA扩增,还表达了一个报告基因LacZ。这可以让检测试纸条改变颜色。然而,如果目标序列存在并因此被扩增,Cas9蛋白会切割DNA,并且没有颜色变化。基于crispr cas9蛋白的方法具有高度的通用性,可以使用不同的gRNA序列,将Cas9蛋白定向到任何具有相邻PAM的指定目标位点。人们还利用cas9蛋白开发了检测其他的疾病的方法,例如检测诊断人乳头状瘤病毒。

  2. 失活的dcas9蛋白

    PC, paireddCas9,成对dCas9报告系统是使用dCas9的系统的一个范例。这项技术由2个dCas9分子组成,每个分子与荧光素酶的半分子相连。当两个dCas9分子被向导RNA(gRNA)引导到相关的病原体基因组中彼此相邻的预先指定的DNA序列时,荧光素酶的两半结合在一起,并发出光。PC-reporter系统非常敏感,可以检测到少至1个DNA分子,并被证明,可以检测结核病等疾病病原体,只要在适当的距离处有2个良好的靶序列,就可以检测到任何病原体DNA序列。

    另一种基于dCas9的诊断系统具有更简单的方法,可用于未纯化的细菌全细胞裂解物。与许多基于CRISPR-Cas9的方法一样,不需要PCR或其他扩增步骤。该方法将His标记的dCas9靶向致病DNA中的特定位点,然后使用nickel-bead pull-down镍珠沉降法将dCas9固定到DNA上。如果检测呈阳性,整个基因组DNA被pull down沉降,而不是剪切或切割。在镍珠步骤之后,将SYBR Green试剂直接添加到沉降的样品中。当SYBR-Green与dsDNA结合时,它会发出强烈的荧光,从而检测dsDNA是否被沉降。

    如果看到正的SYBR Green信号,则已知目标位置存在于样本中。当该方法用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistant S.aureus 时,其荧光信号比对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌methicillin-sensitive S.aureus高10倍以上,显示出高度的特异性。这种约30分钟的快速检测的技术有可用于检测几乎所有的DNA序列。检测限为31ng/mL或10个菌落形成单位(CFU)/mL。只要gRNA序列对相关的病原体具有特异性,这是一种高度特异性的检测方法。

二、Cas12、Cas13和Cas14诊断方法

Cas12酶、Cas13酶和Cas14酶有很多不同的亚型,包括Cas12a蛋白,Cas12b蛋白,Cas13a蛋白,Cas13b蛋白,Cas13d蛋白和Cas14a蛋白。这些crisprcas蛋白酶已经被用于多种快速诊断技术。既可以用单个cas蛋白检测一种病原体,也可以同时使用了几种酶,进行多重分析,以区分多种病原体。

Crisprcas蛋白的附带切割功能

基于Cas12蛋白、Cas13蛋白和Cas14蛋白的诊断技术依赖于一种称为附带切割的过程。当某种酶按照gRNA的指示与靶标结合时,该酶不仅能切割靶标,还能切割目标附近的其他核酸。事实上,在附属切割过程中,Cas12酶和Cas14酶切割附近的ssDNA分子,Cas13酶切割附近的RNA分子。因为一个核酸的许多分子在一个反应中被裂解,这些酶的作用很适合信号放大方案。

SHERLOCK(SpecificHigh-sensitive enzymetic Reporter unLOCKing)技术已用于检测RNA序列,DETECTR(DNA内切酶靶向CRISPRtrans Reporter)技术已用于DNA检测。SHERLOCK和DETECTR都需要在CRISPR裂解步骤之前对目标序列进行恒温温扩增,以获得足够数量的相关序列用于检测。在SHERLOCK中,RDA等温扩增步骤之后是T7转录以产生RNA。在DETECTR中,因为是靶向DNA,而不是RNA,不用执行T7转录。标准的DETECTR使用LbCas12a,它需要一个PAM位点,而SHERLOCK使用一个或多个Cas13蛋白酶和其他酶,去掉了对PAM位点的要求。DETECTR还有一个改进版,它使用Cas14a,这也去掉了对PAM站点的要求。

DETECTR和SHERLOCK检测系统都使用核酸探针。DETECTR用DNA探针,SHERLOCK用RNA探针。探针的一端可能有生物素,另一端有FAM荧光团。核酸探针被Cas蛋白酶切割,让两端分离。对于用FAM萤光团和生物素标记的探针,结果可以在横向流动条上显示,其中正信号显示2条带;负信号只有1条带。其他探针-检测器系统,可以以其他方式读取结果,例如,通过使用荧光板读取器。

DETECTR已被证明能区分两种形式的人乳头瘤病毒HPV。

SHERLOCK已被证明能检测寨卡病毒和登革热病毒,并能检测非小细胞肺癌患者液体活检中的不同突变。

对于大规模的多重病毒检测,已经开发出用于核酸多重评价的组合阵列反应(CARMEN)系统,并显示出很大的前景。使用基于Cas13蛋白的方法进行检测,CARMEN允许1个阵列测试4500多个CRISPR目标。

CRISPR在疾病诊断中的应用前景

迄今为止,基于CRISPR的诊断方法的出版物大多局限于传染病的检测。然而,关于遗传性和其他非传染性疾病和癌症的CRISPR诊断方法的文章也开始出现;一些方法使用了CRISPR筛查方法的创新变体。CRISPR筛查,以前主要用于确定可能的突变位点,之后需要验证,最近被研究作为一种新的方法来确定单个患者在肿瘤中的特异性突变。在快速发展的CRISPR检测诊断研究领域,个性化诊断的应用很可能在不久的将来大量涌现。


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