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史上最全！CRISPR/Cas9基因编辑方法总结 (二)作者：黄潮勇 在上一期的文章里，北京理工大学生命学院黄潮勇博士给大家介绍了几种基于CRISPR Cas9技术和同源重组技术的大肠杆菌基因组编辑方法和CRISPR Cas9基因编辑原理 (点击阅读)，相信对大家有所帮助。黄潮勇博士做了一些大肠杆菌基因组编辑方面的研究，目前已经以**作者身份发表了两篇相关的方法学文章，赞！。美格君邀请黄潮勇博士分享他的研究成果、经验、心得，欢迎大家与黄潮勇博士交流。 黄潮勇博士对CRISPR Cas9技术的兴趣始于一篇发表在《Metabolic Engineering》杂志上的文章 [1]，这篇文章报道了一种高效的大肠杆菌基因组编辑方法(与传统的重组工程相比)——CRISPR Cas9蛋白介导的重组工程，这个方法在上一期美格君的文章里介绍过。
【图1】CRISPR Cas9原版基因组编辑系统 图1展示了这个方法所对应的Cas9基因组编辑系统。 CRISPR Cas9基因编辑的基本步骤大致是：(1) 将宿主菌株制备成感受态细胞，宿主菌株的基因组上提前整合了λ-Red重组系统，在制备感受态细胞的过程中诱导重组酶表达； (2) 将质粒pCas9cur、质粒psgRNA和线性Donor DNA共转入宿主细胞中，或者将质粒psgRNA和线性Donor DNA共转入含有质粒pCas9cur的宿主细胞中； (3) 线性Donor DNA在重组酶的介导下与基因组目标序列发生重组，同时组成型表达的CRISPR Cas9蛋白和sgRNA形成复合体识别并切割尚未重组的基因组序列； (4) 基因编辑成功后诱导质粒pCas9cur上的sgRNA表达，这个sgRNA针对质粒psgRNA上的Amp抗性基因，因此可以除去质粒psgRNA，从而进行下一轮编辑。 CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版一 上面介绍的这个CRISPR Cas9基因编辑方法报道得比较早，因此也被研究者广泛使用，但是这个方法还有很多可以改进的地方。首先，可以将λ-Red重组系统放到质粒上表达，这样既能增加表达量，又方便用于不同的宿主。当然啦，人家作者也提到了这个。其次，质粒消除系统可以改进一下，利用CRISPR/Cas9-sgRNA切割高拷贝的psgRNA质粒难以切割干净，平板上得到的单菌落仍然需要验证Amp抗性。
图2所示是我构建的CRISPR-Cas9基因组编辑系统，这个系统也是一个双质粒系统，为了方便描述，我把这两个质粒分别称为Plasmid#1和Plasmid#2。用双质粒系统的好处是可以把固定不动的组件放在其中一个质粒上(比如这里的Plasmid#1)，把每次编辑都需要变动的组件放到另一个质粒上(比如这里的Plasmid#2)，这样的话，每次编辑时只需要构建一个小的质粒就可以了。在我的系统里，Plasmid#1用来搭载固定不动的组件——Cas9蛋白表达元件和重组酶表达元件，Plasmid#2用来搭载sgRNA表达元件。在质粒消除系统上，我也做了一点改进，我在Plasmid#2上使用低拷贝温敏型复制子pSC101，每一轮编辑之后，只要将阳性克隆放在37℃中培养就可以很快除去这个质粒，再引入新的Plasmid#2进来，进行新一轮编辑；我在Plasmid#1上放了一个sacB基因，含有这个基因的细胞对蔗糖敏感，所以每次最后一轮编辑完成之后，只要将阳性克隆在无抗条件下培养一段时间，再将菌液稀释涂布在含有蔗糖的平板上，长出来的菌落就已经丢失了Plasmid#1。 CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版二 以上所做的改进只是让这个Cas9基因编辑系统更方便使用了，但是并没有提高编辑效率。跟原版的基因组编辑系统一样，基因组编辑系统升级版一依旧采用了线性的Donor DNA，而线性的Donor DNA进入细胞后很容易遭到各种核酸外切酶的攻击，从而降解。
于是，我又对系统进行了一些改进，得到了CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版2，如图3所示。我把Donor DNA插入到Plasmid#2上. 这样做有三个好处： (1) 转化Plasmid#2比共转Plasmid#2和线性Donor DNA效率更高； (2) Donor DNA在质粒上不会受到核酸外切酶的攻击； (3) Donor DNA还可以随着质粒一起复制，增加自己的拷贝数。 这样一来，编辑效率就显著提高了。将Donor DNA插入到Plasmid#2上本质上也改变了同源重组的方式，不再是线性Donor DNA与环状基因组(未被切割)或线性基因组(被切割)之间发生重组，而是环状Donor DNA与线性基因组(被切割)之间发生重组。重组要发生，基因组和Donor DNA之间必须有一方是线性的，环状基因组与环状Donor DNA之间发生重组的概率极低。 上面这个系统虽然可以提高编辑效率，但是编辑效率依然受到转化效率的限制，一般还是需要电转才能达到所需的转化效率，而且一旦哪次感受态细胞没做好，编辑实验就很容易失败。所以我要做的就是让基因组编辑不再依赖高转化效率。
前面的基因组编辑系统为什么需要高转化效率呢？我用一个简单的模型来描述下：假设一管感受态细胞有a个细胞，转化之后有1/b个细胞获得了Plasmid#2，而这些细胞当中有1/c被成功编辑，被成功编辑的细胞中有1/d形成菌落，那么最后能得到的阳性菌落数为N=a*1/b*1/c*1/d。实际上，一管感受态细胞的数目大概就是109，1/b能达到1/100算不错，1/c能达到1/1000算不错，1/d能达到1/10算不错，所以最多也只能得到100-1000个阳性菌落。经验不够的操作者很难做到这样的结果。如果现在我在公式里加一个变量，变成N=a*1/b*2n*1/c*1/d (n可以是任意正整数)，那会怎么样，是不是瞬间觉得1/b、1/c、1/d都不重要了，数值再小也没事。为了做到这一点或部分做到这一点，我把控制Cas9蛋白和sgRNA表达的启动子都换成了严谨性强的诱导型启动子PBAD。在将Plasmid#2转化之后，Cas9蛋白和sgRNA不会表达，这时只要有一个细胞获得了Plasmid#2，就可以通过细胞复制得到无数个含有Plasmid#2的细胞。当细胞数足够多之后再诱导Cas9、sgRNA和重组酶表达，从而启动基因编辑反应，这样可以将编辑效率提高100倍以上。 CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版四 前面提到，将Donor DNA放在Plasmid#2上可以显著提高编辑效率，同时，这也让重组必须在基因组被切割之后发生。重组发生时，线性的基因组链侵入Plasmid#2，并以其为模板进行修复。这个修复的会产生两种结果，一种是我们想要的结果(如图5中的Non-crossover)，另一种是整个Plasmid#2被整合到基因组上(如图5中的Crossover)，这两种重组结果发生的概率基本相等，而用线性Donor DNA就不会出现这个问题。这是一个令人头疼的问题，难道鱼和熊掌真的不能兼得吗？
为了解决这个矛盾，我又想到了一个办法，就是把Donor DNA在基因编辑启动时从Plasmid#2上释放出来，以线性的形式参与重组。要达到这个效果，只需要在Donor DNA两侧加上基因组上的靶位点，如图6所示。这样一来，Cas9蛋白在切割基因组的同时，也会切割Plasmid#2并释放Donor DNA。由于基因组只有一个拷贝，而Plasmid#2有大约5个拷贝，因此只要控制好Cas9蛋白的诱导强度，就可以让基因组被切割，而Plasmid#2部分拷贝被切割，因此可以维持Plasmid#2的存在。
按照这个策略，我测试的结果符合预期，Plasmid#2被整合到基因组上的情况不再发生了，平板上得到的菌落基本都是阳性的。大家可能发现了，图6中有两种Plasmid#2，一种只有一个sgRNA表达元件，一种有两个sgRNA表达元件。对于基因敲除、基因插入、基因替换、DNA大片段插入，只需要在基因组上切一刀就可以了，因此只需要表达一种sgRNA；而对于基因组大片段删除，则需要在基因组上切两刀，分别在要删除的大片段两端切割，这种情况就需要表达两种sgRNA。 结束语 前不久，2020年诺贝尔化学奖揭晓，两位女性科学家获此殊荣。她们凭借的主要是2012年共同发表在Science上的一篇文章 [3]，从这篇文章发表到她们获得诺奖，中间只间隔了短短8年时间，真是非常的Amazing! 在这8年时间里，合成生物学与基因治疗因为CRISPR Cas9技术向前迈进了一大步，这是人类伟大的壮举，向科学家们致敬！ 参考文献 相关阅读 利用CRISPR-CAS9在酵母中高通量构建和分析DNA文库 用RCAS-TVA-CRISPR-Cas9系统编辑体细胞基因组，建立精确的肿瘤模型 |
