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史上最全!CRISPR/Cas9基因编辑方法总结 (二)

作者:黄潮勇

在上一期的文章里,北京理工大学生命学院黄潮勇博士给大家介绍了几种基于CRISPR Cas9技术和同源重组技术的大肠杆菌基因组编辑方法和CRISPR Cas9基因编辑原理 (点击阅读),相信对大家有所帮助。黄潮勇博士做了一些大肠杆菌基因组编辑方面的研究,目前已经以第一作者身份发表了两篇相关的方法学文章,赞!。美格君邀请黄潮勇博士分享他的研究成果、经验、心得,欢迎大家与黄潮勇博士交流


黄潮勇博士对CRISPR Cas9技术的兴趣始于一篇发表在《Metabolic Engineering》杂志上的文章 [1],这篇文章报道了一种高效的大肠杆菌基因组编辑方法(与传统的重组工程相比)——CRISPR Cas9蛋白介导的重组工程,这个方法在上一期美格君的文章里介绍过。

CRISPR Cas9原版基因组编辑系统

【图1】CRISPR Cas9原版基因组编辑系统

图1展示了这个方法所对应的Cas9基因组编辑系统。


CRISPR Cas9基因编辑的基本步骤大致是:


(1) 将宿主菌株制备成感受态细胞,宿主菌株的基因组上提前整合了λ-Red重组系统,在制备感受态细胞的过程中诱导重组酶表达;

(2) 将质粒pCas9cur、质粒psgRNA和线性Donor DNA共转入宿主细胞中,或者将质粒psgRNA和线性Donor DNA共转入含有质粒pCas9cur的宿主细胞中;

(3) 线性Donor DNA在重组酶的介导下与基因组目标序列发生重组,同时组成型表达的CRISPR Cas9蛋白和sgRNA形成复合体识别并切割尚未重组的基因组序列;

(4) 基因编辑成功后诱导质粒pCas9cur上的sgRNA表达,这个sgRNA针对质粒psgRNA上的Amp抗性基因,因此可以除去质粒psgRNA,从而进行下一轮编辑。


CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版一

上面介绍的这个CRISPR Cas9基因编辑方法报道得比较早,因此也被研究者广泛使用,但是这个方法还有很多可以改进的地方。首先,可以将λ-Red重组系统放到质粒上表达,这样既能增加表达量,又方便用于不同的宿主。当然啦,人家作者也提到了这个。其次,质粒消除系统可以改进一下,利用CRISPR/Cas9-sgRNA切割高拷贝的psgRNA质粒难以切割干净,平板上得到的单菌落仍然需要验证Amp抗性。

CRISPR/Cas9基因组编辑系统升级版

【图2】CRISPR/Cas9基因组编辑系统升级版一 [2]

图2所示是我构建的CRISPR-Cas9基因组编辑系统,这个系统也是一个双质粒系统,为了方便描述,我把这两个质粒分别称为Plasmid#1和Plasmid#2。用双质粒系统的好处是可以把固定不动的组件放在其中一个质粒上(比如这里的Plasmid#1),把每次编辑都需要变动的组件放到另一个质粒上(比如这里的Plasmid#2),这样的话,每次编辑时只需要构建一个小的质粒就可以了。在我的系统里,Plasmid#1用来搭载固定不动的组件——Cas9蛋白表达元件和重组酶表达元件,Plasmid#2用来搭载sgRNA表达元件。在质粒消除系统上,我也做了一点改进,我在Plasmid#2上使用低拷贝温敏型复制子pSC101,每一轮编辑之后,只要将阳性克隆放在37℃中培养就可以很快除去这个质粒,再引入新的Plasmid#2进来,进行新一轮编辑;我在Plasmid#1上放了一个sacB基因,含有这个基因的细胞对蔗糖敏感,所以每次最后一轮编辑完成之后,只要将阳性克隆在无抗条件下培养一段时间,再将菌液稀释涂布在含有蔗糖的平板上,长出来的菌落就已经丢失了Plasmid#1。


CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版二

以上所做的改进只是让这个Cas9基因编辑系统更方便使用了,但是并没有提高编辑效率。跟原版的基因组编辑系统一样,基因组编辑系统升级版一依旧采用了线性的Donor DNA,而线性的Donor DNA进入细胞后很容易遭到各种核酸外切酶的攻击,从而降解。

CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版二

【图3】基因组编辑系统升级版二 [2]

于是,我又对系统进行了一些改进,得到了CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版2,如图3所示。我把Donor DNA插入到Plasmid#2上.

这样做有三个好处:

(1) 转化Plasmid#2比共转Plasmid#2和线性Donor DNA效率更高;

(2) Donor DNA在质粒上不会受到核酸外切酶的攻击;

(3) Donor DNA还可以随着质粒一起复制,增加自己的拷贝数。

这样一来,编辑效率就显著提高了。将Donor DNA插入到Plasmid#2上本质上也改变了同源重组的方式,不再是线性Donor DNA与环状基因组(未被切割)或线性基因组(被切割)之间发生重组,而是环状Donor DNA与线性基因组(被切割)之间发生重组。重组要发生,基因组和Donor DNA之间必须有一方是线性的,环状基因组与环状Donor DNA之间发生重组的概率极低。


CRISPR Cas9因组编辑系统升级版三

上面这个系统虽然可以提高编辑效率,但是编辑效率依然受到转化效率的限制,一般还是需要电转才能达到所需的转化效率,而且一旦哪次感受态细胞没做好,编辑实验就很容易失败。所以我要做的就是让基因组编辑不再依赖高转化效率。

CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版三

【图4】CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版三 [3]

前面的基因组编辑系统为什么需要高转化效率呢?我用一个简单的模型来描述下:假设一管感受态细胞有a个细胞,转化之后有1/b个细胞获得了Plasmid#2,而这些细胞当中有1/c被成功编辑,被成功编辑的细胞中有1/d形成菌落,那么最后能得到的阳性菌落数为N=a*1/b*1/c*1/d。实际上,一管感受态细胞的数目大概就是109,1/b能达到1/100算不错,1/c能达到1/1000算不错,1/d能达到1/10算不错,所以最多也只能得到100-1000个阳性菌落。经验不够的操作者很难做到这样的结果。如果现在我在公式里加一个变量,变成N=a*1/b*2n*1/c*1/d (n可以是任意正整数),那会怎么样,是不是瞬间觉得1/b、1/c、1/d都不重要了,数值再小也没事。为了做到这一点或部分做到这一点,我把控制Cas9蛋白和sgRNA表达的启动子都换成了严谨性强的诱导型启动子PBAD。在将Plasmid#2转化之后,Cas9蛋白和sgRNA不会表达,这时只要有一个细胞获得了Plasmid#2,就可以通过细胞复制得到无数个含有Plasmid#2的细胞。当细胞数足够多之后再诱导Cas9、sgRNA和重组酶表达,从而启动基因编辑反应,这样可以将编辑效率提高100倍以上。


CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版四

前面提到,将Donor DNA放在Plasmid#2上可以显著提高编辑效率,同时,这也让重组必须在基因组被切割之后发生。重组发生时,线性的基因组链侵入Plasmid#2,并以其为模板进行修复。这个修复的会产生两种结果,一种是我们想要的结果(如图5中的Non-crossover),另一种是整个Plasmid#2被整合到基因组上(如图5中的Crossover),这两种重组结果发生的概率基本相等,而用线性Donor DNA就不会出现这个问题。这是一个令人头疼的问题,难道鱼和熊掌真的不能兼得吗?


CRISPR CAS9基因编辑同源重组的两种结果

【图5】同源重组的两种结果 [2]

为了解决这个矛盾,我又想到了一个办法,就是把Donor DNA在基因编辑启动时从Plasmid#2上释放出来,以线性的形式参与重组。要达到这个效果,只需要在Donor DNA两侧加上基因组上的靶位点,如图6所示。这样一来,Cas9蛋白在切割基因组的同时,也会切割Plasmid#2并释放Donor DNA。由于基因组只有一个拷贝,而Plasmid#2有大约5个拷贝,因此只要控制好Cas9蛋白的诱导强度,就可以让基因组被切割,而Plasmid#2部分拷贝被切割,因此可以维持Plasmid#2的存在。

CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版四

【图6】CRISPR Cas9基因组编辑系统升级版四 [2]

按照这个策略,我测试的结果符合预期,Plasmid#2被整合到基因组上的情况不再发生了,平板上得到的菌落基本都是阳性的。大家可能发现了,图6中有两种Plasmid#2,一种只有一个sgRNA表达元件,一种有两个sgRNA表达元件。对于基因敲除、基因插入、基因替换、DNA大片段插入,只需要在基因组上切一刀就可以了,因此只需要表达一种sgRNA;而对于基因组大片段删除,则需要在基因组上切两刀,分别在要删除的大片段两端切割,这种情况就需要表达两种sgRNA。


结束语

前不久,2020年诺贝尔化学奖揭晓,两位女性科学家获此殊荣。她们凭借的主要是2012年共同发表在Science上的一篇文章 [3],从这篇文章发表到她们获得诺奖,中间只间隔了短短8年时间,真是非常的Amazing! 在这8年时间里,合成生物学与基因治疗因为CRISPR Cas9技术向前迈进了一大步,这是人类伟大的壮举,向科学家们致敬!


参考文献

[1] Metab Eng (2015) 31:13-21
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2015.06.006
[2] Appl Microbiol Biotechnol (2020) 104:7943-7956
https://doi.org/10.1007/s00253-020-10819-1   
[3] Science (2012)   337, 816-821
https://doi.org/10.1126/science.1225829


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