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美格生物转录组学测序分析

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技术简介

什么是转录组?

转录组(transcriptome)是某个物种或特定细脃类型产生的所有转录本的集合,广义上指某一生理条件下,细胞内所有转录产物的集合,包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA;狭义上指所有mRNA的集合。

蛋白质是行使细胞功能的主要承担者,蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述,转录组成为研究基因表达的主要手段,转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带,转录水平的调控是目前研究最多的,也是生物体最重要的调控方式。


转录组测序的研究对象


转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,主要包括 mRNA和非编码RNA 。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点,通过新一代高通量测序,能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和,主要包括mRNA和非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构,揭示特定的生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。,已广应用于植物候选基因发掘、功能鉴定及遗传改良基础研究、临床诊断和药物研发等領域


新一代转录组测序


随着新一代测序平台的市场化,RNA测序(RNA sequenclng,RNA-Seq)技术已成为了转录组学研究的重要手段之一。该技术利用新一代高通量测序平台对基因组cDNA测序,通过统计相关Reads(用于测序的cDNA小片段)数计算出不同mRNA的表达量,分析转录本的结构和表达水平,同时发现未知转录本和稀有转录本,精确地识别可变剪切位点以及编码序列单核苷酸多态性,提供最全面的转录组信息

基于Illumina高通量測序平台的转彔组测序技术,能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测,在分析转录本的结构和表达水平的同时,还能发现未知转录本和稀有转录本,精确地识别可变剪切位点以及cSNP(编码序列单核苷酸多态性),提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台,转录组测序无霈预先针对已知序列设计探针,即可对任意物种的整体转录活动进行检测,提供更精确的数字化信号,更高的检测通量以及更广泛的检测范围,是目的深入研究转录组复杂性的强大工具。


转录组学测序流程

RNA片段化处理反转录合成cDNA DNA测序接头连接PCR扩增文库深度测序图像识别 RNA序列信息

转录组测序分析内容

一、原始转录组测试数据

二、测序评估及低质量过滤

 1、无参转录组数据分析

      1.1、Unigene的组装和功能注释

         1.2、Unigene的编码蛋白框CDS预测

       1.3、SSR/SNP位点寻找

       1.4、Unigene表达量差异分析

       1.5、GO功能显著性富集、Kegg通路显著性富集


  2、有参转录组数据分析

        2.1、对比到参考基因组

                2.1.1、可变剪切分析

                2.1.2、基因融合分析

                2.1.3、SNP/InDel分析

        2.2、基因拼接与注释

        2.3、基因差异表达分析

                2.3.1、蛋白互作网络

        2.4、GO功能显著性富集、Kegg通路显著性富集


送样要求

RNA样本

1样本总量:建议送样量≥10ug,对于总量≥1ug的样本可以采用风险建库;

2样本浓度:最低50ng/ul

3样本纯度:OD260/280=1.80-2.00,RIN≥7.0;

4样本保存期间切忌反复冻融,送样时请使用干冰运输。

cDNA样本

1样本总量:送样量≥2ug;

2样本浓度:最低10ng/ul

3样本纯度:OD260/280=1.80-2.00,RIN≥7.0;

4样本保存期间切忌反复冻融,送样时请使用干冰运输。


案例分享:Genome Res: 转录组测序分析发现大量低表达丰度的新转录本

研究目的

利用高通量测序技术研究水稻转录本

材料方法

8个不同的水稻组织,采用单端+双端的测序策略

研究结果

通过与水稻cDNA数据库比对,发现这些新转录本主要是低丰度转录本。这表明相对于传统方法,转录组测序能发现更多的低丰度基因(如下图所示)。

转录组学测序分析

转录组测序与cDNA测序相比可以发现更多低拷贝转录本

A. 新鉴定转录本长度分布 B. 新转录本与cDNA基因表达水平比较图


参考文献

Zhang GJ, Guo GW, Hu XD, et al. Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome. Genome Res, 2010, 20:646-654.


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