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RNase HII依赖性PCR-rhPCR技术的原理与应用

作者:Magigen

什么是rhPCR?

rhPCR, 英文名RNaseH-dependent PCR,中文名称核糖核酸酶H依赖性PCR。rhPCR是对标准PCR技术的改进。在rhPCR中,引物的3'端设计有一个可移动的扩增区。带阻断引物的扩增依赖于耐高温RNase HII酶在与互补靶序列杂交期间的裂解活性。这种核糖核酸酶RNase HII具有一些有用的特性,可以增强PCR。首先,它在低温下几乎没有酶活性,可以在不修改DNA聚合酶的情况下进行“热启动PCR”。其次,在RNA残基附近存在错配时,酶的切割效率降低。这可以减少引物二聚体的形成,检测选择性剪接变异体,可以使用更多的PCR引物进行多重PCR的能力,以及检测单核苷酸多态性。

rhPCR引物结构

rhPCR引物由三部分组成。

1) 5' DNA片段,在长度和熔化温度(Tm)要求上与标准PCR引物相当,在被RNase HII酶切割后延长。

2) 单个RNA碱基,为RNase-HII提供切割位点。

3) 四个或五个碱基长度的短3'延伸,加上阻断,通常是一个短的,不可延伸的分子,如丙二醇,可以阻止DNA聚合酶的延伸,直到该阻断被移除。

rhPCR的工作原理和过程

rhPCR反应开始时,溶液中引物和模板是游离的。当游离时,这些引物不会被RNase HII酶切割,只有这些引物与带有特定模板的RNA:DNA异源双链结合,才可以被切割。一旦与模板结合,rhPCR引物被耐热RNase H2酶切割。切割行为去除了阻断,使得DNA聚合酶可以从引物中延伸出来。Magigen RNase H2酶具有很高的热适应性和转化率,使其在热循环过程中以较高的实时转化率进行反应。切割发生在RNA碱基的5'侧。它留下一个带有3’-羟基的DNA寡核苷酸,可以作为引物发挥作用。PCR反应的循环继续这个过程。rhPCR引物需要进行设计,使引物被RNase-H2酶切割后,熔化温度仍大于PCR反应的退火温度。这些引物可用于5'核酸酶Taqman和SYBR-Green型定量PCR。

Magigen RNase HII酶依赖性PCR/RHPCR原理图

图1 使用通过用RNase H2切割、激活的被阻断的引物,进行PCR的偶联反应原理图(rhPCR)。

PCR引物被设计为不能被DNA聚合酶延伸,并且在3'末端附近含有单个核糖核苷酸残基。引物与模板的杂交形成RNase HII的底物,RNase HII将引物5'端切割至RNA碱基,留下具有能够引发DNA合成的3'-OH的DNA寡核苷酸。该检测可以使用2步或3步PCR进行,退火/延伸时间短至30秒。



rhPCR的应用


rhPCR可用于定量PCR和医学或环境实验室:

•基因表达分析

•选择性剪接

•SNP基因分型


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