RNase HII依赖性PCR-rhPCR技术的原理与应用

什么是rhPCR?

rhPCR, 英文名RNaseH-dependent PCR，中文名称核糖核酸酶H依赖性PCR。rhPCR是对标准PCR技术的改进。在rhPCR中，引物的3'端设计有一个可移动的扩增区。带阻断引物的扩增依赖于耐高温RNase HII酶在与互补靶序列杂交期间的裂解活性。这种核糖核酸酶RNase HII具有一些有用的特性，可以增强PCR。首先，它在低温下几乎没有酶活性，可以在不修改DNA聚合酶的情况下进行“热启动PCR”。其次，在RNA残基附近存在错配时，酶的切割效率降低。这可以减少引物二聚体的形成，检测选择性剪接变异体，可以使用更多的PCR引物进行多重PCR的能力，以及检测单核苷酸多态性。

rhPCR引物结构

rhPCR引物由三部分组成。

1） 5' DNA片段，在长度和熔化温度（Tm）要求上与标准PCR引物相当，在被RNase HII酶切割后延长。

2） 单个RNA碱基，为RNase-HII提供切割位点。

3） 四个或五个碱基长度的短3'延伸，加上阻断，通常是一个短的，不可延伸的分子，如丙二醇，可以阻止DNA聚合酶的延伸，直到该阻断被移除。

rhPCR的工作原理和过程

rhPCR反应开始时，溶液中引物和模板是游离的。当游离时，这些引物不会被RNase HII酶切割，只有这些引物与带有特定模板的RNA:DNA异源双链结合，才可以被切割。一旦与模板结合，rhPCR引物被耐热RNase H2酶切割。切割行为去除了阻断，使得DNA聚合酶可以从引物中延伸出来。Magigen RNase H2酶具有很高的热适应性和转化率，使其在热循环过程中以较高的实时转化率进行反应。切割发生在RNA碱基的5'侧。它留下一个带有3’-羟基的DNA寡核苷酸，可以作为引物发挥作用。PCR反应的循环继续这个过程。rhPCR引物需要进行设计，使引物被RNase-H2酶切割后，熔化温度仍大于PCR反应的退火温度。这些引物可用于5'核酸酶Taqman和SYBR-Green型定量PCR。

图1 使用通过用RNase H2切割、激活的被阻断的引物，进行PCR的偶联反应原理图（rhPCR）。

PCR引物被设计为不能被DNA聚合酶延伸，并且在3'末端附近含有单个核糖核苷酸残基。引物与模板的杂交形成RNase HII的底物，RNase HII将引物5'端切割至RNA碱基，留下具有能够引发DNA合成的3'-OH的DNA寡核苷酸。该检测可以使用2步或3步PCR进行，退火/延伸时间短至30秒。

rhPCR的应用

rhPCR可用于定量PCR和医学或环境实验室：

•基因表达分析

•选择性剪接

•SNP基因分型

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