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华盛顿大学的研究人员开发出新的蛋白报告子,针对单分子蛋白质组学

华盛顿大学的研究人员开发了一种新的蛋白质报告标签,可以使用牛津纳米孔的Minlon纳米测序平台读取。华盛顿大学的研究助理教授和该研究的资深作者Nivala说,这种标签提供了一种潜在的替代品,可以替代常用的基于荧光的报告子,并可能在多种研究领域有用,包括合成生物学和细胞信号通路的研究。 该研究成果本周发表在《自然生物技术》(Nature Biotechnology)上。

这项研究也是使用商用纳米孔测序装置进行蛋白质分析的首批实例之一,并提供了用该技术实现单分子蛋白质测量的一个例子。该方法使用工程蛋白质,称为纳米孔传感器,或NTER,经过设计,使其易于被纳米孔传感器捕获和读取。


NTER由三个主要部分组成:

带负电的C端结构域,很容易被纳米孔捕获;

折叠结构域,防止完整蛋白质通过纳米孔;

分泌结构域,其使所述蛋白质从所研究的细胞中分泌出来,并在其表达后分泌到细胞外培养基中。


肽条形码被整合到NTR的C端部分,纳米孔读取这些条形码,并使用它们来识别和量化不同NTER的水平。

NTER可以进行基因编码, 并作为靶蛋白的一部分表达,其方式与传统荧光报告蛋白基本相同。

Nivala说:“不过,与传统报告子相比,他们有许多优势。条形码空间比荧光蛋白大得多,”这允许更高层次的多路传输/复用。


“在蛋白质的结构上,你也有更多的灵活性,”他说, 你想让它分泌,还是不分泌?它需要尽可能小吗?它需要非常亲水吗?

因为我们真正需要做的就是把这个C-末端尾巴放在目标蛋白质上,这样它就会被毛孔捕获,然后一些任意的肽条形码处理后进入这个尾巴。”

另一方面,荧光蛋白报告子通常不太可调,你可以对它们进行变异,并对它们进行工程设计,等等,但程度有限。

与传统报告子一起收集严格的定量数据也很困难。它们形成二聚体。它们可以形成聚集体。根据不同的变体,它们中的许多会或多或少地表达出来。所以很难绝对定量。

"这在多路复用时尤其如此,你必须小心比较它们的强度,并从这些不同的变体中推断出相对表达水平。”Nivala指出,传统荧光报告的一个吸引人的特点是其方便性。

“有很多不同的方法来读取它们……你不必做任何净化,因为光只是从样品中发出的。”他说,他和他的同事们试图使NTER同样易于使用。

“我们希望有一种类似的方法,只需极少量的样品处理。”Nivala告诉Magigen。他们设计了一种具有分泌结构域的纳米孔,因此当它们在细胞中表达时,它们会被排泄到培养基中,然后我们可以直接将培养基加载到纳米孔流动细胞中……这样就可以直接从培养基样本中捕获蛋白质,并开始读取条形码。

华盛顿大学的研究小组将九种不同的NTER进行了复合,研究人员迄今为止已经产生了大约20种不同的条形码。在NTER方法中,纳米孔不是对肽条形码的每个氨基酸进行测序,而是根据孔内大约17个氨基酸的全长行为生成信号。

华盛顿大学的研究人员使用卷积神经网络来分析和区分不同条形码产生的信号。虽然这种方法很好地实现了一组相对较小的不同NTR的生产,但扩展是一个挑战。“这是一种有监督的学习方法,所以我们需要每种可能的条形码的训练数据,我们希望将来能有一个可推广的模型,在这个模型中,给定任何特定的肽序列,你可以预测它将给你什么信号,反之亦然——对于你第一次看到的信号,你可以预测产生该信号的可能肽序列。” Nivala说。他正在与外界讨论这项技术的潜在许可问题。他说,NTER很可能会立即在合成生物学应用中得到应用,他们可以帮助评估合成基因回路是否按照预期的方式生产所需的蛋白质和所需的数量。

合成生物学研究人员通常将一个系统设计成特定的规格,而大部分情况下,回路不完全符合他们的要求。NTER有助于加快调试过程,进而有助于加快合成系统的整体开发。”即使有20名不同的报告子,也可能改变合成生物学研究人员的游戏规则,让他们更有效地了解他们正在设计的回路发生了什么。”Nivala说。

由于NTER条形码可编码为包括翻译后修饰位点,并且PTM的存在可通过纳米孔传感器检测,因此试剂也可用于通过PTM(如磷酸化)观察在信号通路中连接的蛋白质组,让研究人员梳理出这些通路的结构,以及它们如何在各种扰动下发生变化。

Nivala说,他和他的同事们还正在研制一种扩展版的报告子,该报告子将组合多个条形码,使它们穿过纳米孔,他预计这种纳米孔可以将多路复用扩展到数百万种蛋白质中。

可以实现大规模平行分析。

以识别单个氨基酸的方式收集和解释通过纳米孔的肽的信号是基于纳米孔的蛋白质测序的主要挑战之一,华盛顿大学研究团队的条形码方法可能会绕过这一挑战。

纳米孔是蛋白质测序的有力竞争者,因为它具有线性读取肽的能力,它们有难以置信的灵敏度,经验证的单分子能力,在并行读取中扩展的潜力。但考虑到这是研究的早期阶段,很难预测最终获胜的技术。


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