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G-triplex-CRISPR-Cas12a,一种全新、灵敏的快速检测方法

作者:LI TAO

摘要

CRISPR Cas12a(Cpf1)可以反式切割ssDNA,该特征已被广泛用于核酸检测。

在这里,我们介绍了一种新型的Cas12a报告基因,G-triplex(G3)和一种称为G-CRISPR的高灵敏度生物传感器。

我们证明CRISPR Cas12a可以在约10分钟内反式切割G3结构,利用这种切割诱导的高级结构破坏方式,G3可以作为出色的报告子。

G3报告基因将检测灵敏度提高了20倍,对于未扩增和扩增DNA,检测灵敏度分别到低至50 pmol和0.1 amol(一拷贝/反应)。

G-CRISPR已被用于分析具有HPV感染风险的27个PCR扩增患者样品,分别利用荧光和侧流测定,两者结果100%的一致性。

与临床结果相比,其总体特异性和敏感性分别为100%和94.7%。这些结果表明,G-CRISPR可以作为快速,灵敏和可靠的生物传感器,并可以进一步扩展CRISPR工具在生物医学诊断中的应用。

1. 介绍

CRISPR/Cas系统作为细菌和古细菌的适应性免疫系统,可以保护它们免受入侵噬菌体、病毒和质粒的侵害。

在病原体与其宿主之间的相互作用期间,CRISPR-Cas机制在CRISPR RNA(crRNA)的指导下切割特定的DNA。

随着许多CRISPR-Cas蛋白如Cas9,Cas12a,Cas12b, Cas13和Cas14的出现,科学家们已经利用这一特性来彻底改变基因编辑。

最近,越来越多的研究表明,某些CRISPR-Cas蛋白在靶向特异性切割(称为顺式切割)后,在非特异性靶标上表现出附带切割(称为反式切割)属性。

利用这一特殊属性,人们已经开发了许多基于CRISPR的护理点(POC)平台(例如SHERLOCK),用于人类基因分型和病原体检测,具有高特异性和灵敏度。


在CRISPR蛋白中,CRISPR Cas12a(也称为Cpf1)提供混杂的核酸内切酶活性,其反式切割的是ssDNA(不是dsDNA和RNA)。

Chen等人使用ssDNA作为报告基因,建立了“DETECTR”平台,实现了对人乳头瘤病毒(HPV)的阿托摩尔(aM)级别灵敏度的检测。

Li等人实施了类似的ssDNA-FQ报告基因,并开发了一种名为'HOLMES'的系统,并检测了伪狂犬病病毒(RNA)和日本脑炎病毒(RNA)。

其灵敏度约为10aM,用于检测放大目标。此后,人们已经提出了许多其他策略,来优化基于CRISPR Cas12a蛋白的平台的性能,

例如使目标类型多样化(例如,将适体组合以检测蛋白质,除DNA/RNA之外的小分子),又比如,简化操作方案(例如,自动样品提取,一管检测),避免使用读取器。

优化的另一个关键目标是提高检测灵敏度,这可以减少检测时间而不牺牲早期病毒感染期间的准确性。

例如,研究人员引入了两种crRNA,并用Mn2+取代Mg2+以增加Cas12a蛋白活性,两者都实现了几个核酸拷贝的检测灵敏度。

然而,据我们所知,目前基于CRISPR Cas12蛋白的检测系统通常使用ssDNA作为报告基因,这使得进一步提高灵敏度受到限制。

G-triplex-CRISPR-Cas12a,一种全新、灵敏的快速检测方法,G CRISPR

图. G-CRISPR-Cas12a检测原理、流程


最近,我们报道了活化的CRISPR/Cas12a系统、反式切割DNA G-四联和体(G4s)。

然而,由于其高稳定性,需要很长时间(长达数小时)切割G4结构。G-triplex(G3)是一种类似G4的DNA模体,具有三链非规范二级结构,可由富含鸟嘌呤的DNA序列,通过Hoogsteen类氢键形成。

G3最初被认为是具有潜在重要细胞功能的G4的中间形式,进一步的研究显示,少数序列可以形成稳定的G3结构,尽管不如G4稳定。

G3与G4具有多种性质,例如,对许多刺激,如金属离子,氯化血红素,硫黄素T,敏感,因此它已经被用于各种类型生物传感器。

例如,通过从G4序列截短四个碱基(GGGA)获得的G3序列似乎显示出与亚甲蓝(MB)的强亲和力,并且可以通过亚甲蓝稳定。

该特征被用于开发用于灵敏检测可卡因的电化学生物传感器。

在这项工作中,我们发现CRISPR Cas12a蛋白可以反式切割G3,并基于这一发现开发了一个敏感的核酸检测平台。我们选择了两个典型的G3序列,TBA11(凝血酶结合适体截短形式,简称TBA)和端粒G3,据报道它们不太稳定,并研究了Cas12a蛋白对它们的切割活性。

结果表明,CRISPR Cas12a在几分钟内反式切割两种G3结构,切割速率远高于G4。


我们用荧光光谱,圆二色(CD)光谱,凝胶电泳和核磁共振(NMR)实验验证了这种反式切割活性。

由于G3对各种刺激作出反应,并且可以被CRISPR Cas12a系统快速降解,因此它可能是基于其在切割之前和之后的高阶结构变化、构建快速生物传感器的有希望的报道基因。

因此,我们通过将CRISPR-Cas12a与TBA11-G3报道分子整合,来开发G-CRISPR平台。

使用G-CRISPR,我们成功区分了SARS-CoV-2和SARS-CoV N基因,以及HPV16和HPV18 L1基因质粒。

该系统分别对未扩增和扩增的HPV16质粒实现了50 pM和0.1 aM(每个反应单拷贝)的检测灵敏度,比基于ssDNA报告分子的CRISPR Cas12a系统提高了20倍。

此外,我们使用基于荧光和侧向流动的G-CRISPR测定,证明了27个患者样品中HPV16和HPV18的检测是成功的。

结果与临床报告高度一致,特异性和敏感性分别为100%和94.7%。

总体而言,G-CRISPR为核酸检测提供了高灵敏度和准确性,并具有进一步扩展CRISPR Cas12a生物传感工具的巨大潜力。


2. 实验材料

G-triplex (G3), G-quadruplex (G4), 和crRNA序列均来自中国上海Sangon公司。

利用PCR方法,分别从pUC57-SARS-CoV-2-N、pUC57-SARS-CoV-N、pUC57-HPV16-L1和pUC57-HPV18-L1载体中扩增SARSCoV-2-N基因、SARS-CoV-N基因、HPV16-L1基因和HPV18-L1基因。

PCR-Master-Mix从中国上海Yeasen公司购买,质粒的PCR产物在使用前通过Axygen公司凝胶提取试剂盒纯化。

所用引物和载体由Tsingke公司(中国北京)合成。使用的DNA和RNA序列列在支持信息中(表S1)。

DNA琼脂糖和核酸凝胶染色剂购自Yeasen公司。TEMED、(NH4)2S2O8、尿素、30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液和10%× TBE缓冲液购自Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA)。

Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a(Magigen CRISPR LbCas12a蛋白)购自中国广州美格生物科技公司。

横向流动免疫层析试纸条(Milenia HybriDetect 1)来自英国TwistDx公司。


参考文献


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