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研究人员成功开发出一种迷你的CRISPR Cas14基因编辑系统

人们常常将CRISPR基因编辑技术比喻为分子剪刀,可以切割DNA的特定部分。斯坦福大学生物工程助理教授Stanley Qi喜欢这个类比,但他认为是时候把CRISPR编辑变成一把更加锋利灵巧的瑞士军刀了。

CRISPR可以像切割机一样简单,也可以像编辑器或成像仪一样更高级。这一领域正在涌现出许多令人兴奋的应用。

然而,用于眼睛、肝脏和大脑疾病基因治疗的许多不同的CRISPR系统、或正在进行临床试验的CRISPR系统,其使用范围仍然受到许多限制,因为它们都有相同的缺陷:它们太大,因此很难进入细胞、组织或活生物体。

在9月3日发表在《分子细胞》上的一篇论文中,Stanley Qi和他的合作者公布了他们研究成果,他们将CRISPR基因编辑推进了的重要一步:开发了一个高效、多用途的迷你CRISPR Cas14基因编辑系统。我们通常使用的CRISPR系统,如Cas9和Cas12a,一般由大约1000到1500个氨基酸组成,而Stanley Qi团队开发的“CasMINI”系统有只有529个氨基酸。

研究人员在实验中证实,CasMINI可以删除、激活和编辑遗传密码,就像其他的强大对手一样。该系统体积更小,更容易进入人体细胞和人体,成为治疗各种疾病的潜在工具,包括眼部疾病、器官退化和遗传疾病。

CRISPR Cas14基因编辑系统


CRISPR Cas14蛋白工程迭代

为了使系统尽可能小,研究人员决定从CRISPR蛋白Cas12f蛋白(也称为Cas14蛋白)开始,因为它只包含大约400到700个氨基酸。然而,与其他CRISPR蛋白一样,Cas12f蛋白天然来源于古细菌单细胞生物,这意味着它不适合哺乳动物细胞,更不用说人类细胞或身体了。已知只有少数CRISPR蛋白在哺乳动物细胞中不经修饰即可发挥作用。不幸的是,Cas14蛋白不是其中之一。这是一个非常大的挑战。

"数百万年的进化并没有能够将这个CRISPR系统转变成在人体内起作用的东西。我们能在一两年内实现这一点吗?"Qi告诉Magigen, “但是,据我所知,我们第一次将不工作的CRISPR变成了可以工作的CRISPR。”

事实上,Qi实验室的博士后学者、论文的主要作者Xiaoshu Xu在哺乳动物细胞中未发现天然Cas12f(Cas14蛋白)的活性。Xu和Qi认为问题在于人类基因组DNA比微生物DNA更复杂,更难获得,这使得Cas12f很难在细胞中找到目标。通过观察Cas12f系统的预测结构,Xu仔细选择了大约40个可能绕过这一限制的蛋白质突变,并建立了一条一次测试许多蛋白质变体的管道。理论上,一种有效的变体可以通过激活基因组中的绿色荧光蛋白(GFP)使人类细胞变绿。

研究人员将RNA工程和蛋白质工程应用于V-F型Cas12f(Cas14)系统,并生成一个紧凑、高效和特异的哺乳动物基因组工程系统,称之为CasMINI。通过优化单导向RNA(sgRNA)设计, 并进行多轮迭代蛋白质工程和筛选,产生了一类Cas12f变体(即CasMINI),当与转录激活剂融合时,可以有效激活报告基因和内源性基因表达。

本研究中使用的Cas12f来源于未经培养的古细菌,具有TTTR PAM。使用设计的sgRNA,CRISPR相关RNA(crRNA)和反式作用crRNA(tracrRNA)之间的嵌合RNA融合,先前可以体外双链DNA切割。

通过将两个突变(D326A和D510A)引入RuvC结构域中Cas12f的保守活性位点,来产生核酸酶失活的Cas12f(dCas12f)。将得到的dCas12f蛋白与三联VP64-P65AD-Rta(VPR)转录激活因子融合。

“起初一年,这个系统来根本不起作用,”Xu说, ”但经过生物工程迭代,我们看到一些工程蛋白质开始像魔法一样启动。这让我们真正体会到合成生物学和生物工程的力量。”

第一次成功的结果并不多,但它们让Xu兴奋不已,并鼓励她继续前进,因为这意味着这个系统能够工作。经过多次迭代,她能够进一步提高蛋白质的性能。”我们一开始只看到两个细胞显示绿色信号,现在经过改造,在显微镜下几乎每个细胞都是绿色的。”

“有些时候,我不得不阻止这一切,”Qi说‘我们做了一个很好的系统。应该考虑如何将这种分子用于实际应用。”

除了蛋白质工程,研究人员还设计了RNA,将Cas蛋白引导至其目标DNA。对这两种成分的修饰对于使CasMINI系统在人类细胞中工作至关重要。他们测试了CasMINI在实验室人类细胞中删除和编辑基因的能力,包括与HIV感染、抗肿瘤免疫反应和贫血相关的基因。它几乎作用于他们测试的每一个基因,在几个基因中有强烈的反应。


打开未来CRISPR基因编辑应用的大门

研究人员已经开始与其他科学家合作,进行基因治疗。他们也对2019冠状病毒疾病的进展有兴趣,如RNA疫苗的研制,其中大小也可以是限制因素。

自CRISPR被发现以来,这种设计这些系统的能力在该领域一直是人们所渴望的,这一新的工程方法可以提供广泛的帮助,为新的应用打开了大门。


参考文献

Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing

Xiaoshu Xu et. al


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