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空间转录组分析


Visium空间转录组技术

基因表达的空间定位与测量

为什么空间分析重要?我们知道位置决定了房地产的价值,细胞在组织中的位置也很重要。有了空间上的信息,研究人员可以发现更多有价值的东西。

复杂的异质组织由多种细胞类型和空间组成。对这些复杂的异质组织的研究,需要有能够评估基因表达谱以及多种细胞类型和状态的空间组织的工具。

空间转录组技术在细胞和分子水平上对组织的正式分析提供了生物学信息,同时保留了组织和细胞微环境的组织。

空间转录组分析中没有组织解离偏,因为组织是完整的,并可以确定异质组织中的细胞类型。

Visium空间基因表达解决方案将形态背景与应用于整体组织切片的无偏、高通量的mRNA分析结合。Visium空间基因表达技术将空间定位与测量这两种互补研究组织的方法结合到一起,提供了一种以前无法获得的组织生物学视角

10X公司的Visium空间基因表达解决方案,提供了分析空间整体转录组的方法。通过将总mRNA基因表达数据与形态H&E染色的图像相叠加,利用Visium,研究人员可以从整个组织切片和各种各样的样本类型中获得整个转录组高通量基因表达分析结果。该解决方案使研究人员能够揭示正常和患病组织的生物学结构,并发现新的组织生物标志物。

而且,通过使用现有的实验室设备和组织分析工具,可以轻松地将visium集成到当前的工作流程中在一个工作日之内完成从对样本切片到建好测序文库的端到端工作流程。也可以按需要设置暂停点,稍后继续实验。


技术原理

研究人员使用载有poly A捕获和新型空间条形码技术的载玻片绘制复杂组织样品的空间基因表达图。

载玻片                   捕获区域                条形码点                            寡核苷酸链

1。Visium空间基因表达载玻片的组成。每张载玻片包含四个捕获区域,一张载玻片可以容纳四张单独的组织切片每个区域有大约5000个条形码点,而每个点又包含数百万个带有空间条形码Barcode捕获寡核苷酸。这些含有聚(dT)的寡核苷酸链可捕获mRNA。寡核苷酸链有唯一的分子标识符UMI对mRNA分子进行计数,可查看mRNA在捕获区域中的来源。每个斑点的直径为55微米,因此根据组织类型,每个斑点可以检测到1-10个细胞。

组织mRNA被释放并与条形码寡核苷酸结合,从而能够捕获基因表达信息。


文库分步构建

工作流程

首先将新鲜的冷冻组织切片放入visium空间基因表达载玻片上的4个捕获区域。利用标准的固定和染色技术(包括苏木精和伊红H&E染色)在载玻片上对组织切片进行染色。

然后组织被通透化也就是在细胞上打出小孔,目的是从细胞中释放出mRNA。mRNA与斑点上存在的空间条形码寡核苷酸结合。逆转录反应从捕获的mRNA中产生cDNA。cDNA的第二条链被合成,并解链。接下来是得到带有条形码的cDNA被合并在一起,用于下游制备文库和cDNA扩增。采取后续步骤来片段化和处理cDNA,以成准备用于测序的文库。

然后是最后的为样本加上索引序列的PCR反应可通过索引index序列来区分某条read来自于哪一个原始文库,为了能在测序中对多个文库进行合并测序。使用标准的短读长测序仪对visium空间基因表达文库进行测序。

使用10x基因组学软件工具Space Ranger分析流程软件和Loupe Browser浏览器对数据进行可视化处理和可视化。Space Ranger支持基于基因表达的自动化数据、和图像处理聚类分析、以及可行的QC统计数据。Loupe Browser可实现交互式数据的可视化和浏览,结果可轻松导出和共享。

注意:如果您是首次使用visium解决方案来分析组织样本,则在开始整个工作流程之前,您需要对组织样本处理流程进行优化。

然后将这种基因表达数据分层组织切片,用高分辨率显微镜得到图像。这使得有可能以空间分辨的方式,可视化组织形态内的任何mRNA或mRNA组合的表达可视化


海马基因Selenow表达

Selenow独特分子标识符UMI

海马基因Hpca表达

Hpca独特分子标识符UMI


2。这是一个覆盖了空间基因表达信息的小鼠大脑冠状切片。斑点对应于指定位置SelenowHpca的mRNA,两者都显著的海马表达。


样品制备         文库制备

组织制备                 染色和成像                            透化                           cDNA合


3。使用Visium空间基因表达解决方案构建测序文库。


实验准备

显微镜和成像系统和规格,任何具有下列功能的等效系统都可用于成像。

Nikon Eclipse Ti2明场荧光显微镜

ImageXpress Nano Automated Cell Imaging System细胞影像系统


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