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使用抗生素后肠道生态恢复的微生物决定因素

作者:Niranjan Nagarajan来源:Nautre

人类肠道微生物群含有数以万亿计的细菌,提供多种代谢能力,并在宿主健康中发挥重要作用,特别是能量代谢,免疫稳态和异生素代谢。

一个稳定的共生菌群也被认为在抵抗病原体定植方面发挥关键作用,多样性降低与感染风险增加有关。

最近的一些研究进一步强调了肠道微生物组对宿主健康的重要性,特别是在婴儿和老年人中,多样性的改变和丧失与各种代谢,免疫逻辑和神经疾病有关,对癌症免疫治疗的反应较差。

在已知扰乱肠道微生物组的许多因素中,抗生素是导致深刻和长期改变的主要原因。

抗生素相关性腹泻和艰难梭菌结肠炎是微生物组被破坏的常见早期并发症,而抗生素也选择耐药基因和生物体,从而产生用于传播抗性基因盒的储库。

在中长期内,微生物群落的恢复可能缓慢且多变,并且取决于初始状态。流行病学和模式生物研究表明,抗生素使用的长期后果包括儿童免疫疾病,成人代谢紊乱和感染风险增加。

一些研究指出,要从抗生素诱导的扰动后更好恢复,可能与肠道微生物群落高的初始多样性有关。

此外,在一些研究中,特定抗生素抗性基因的携带与恢复过程有关。

虽然预计对所用抗生素具有抗性的细菌在播种肠道再增殖方面具有优势,但尚不清楚只是抗生素抗性是必须的或是否足以恢复肠道微生物组的生态和功能丰富性。

我们不知道哪些特定的微生物类群及其实现的功能,加速或阻碍了这一过程,并解释个体之间恢复速度和程度的实质性变化。

例如,虽然常用的益生菌通常对宿主健康有益,但抗生素治疗后的效用仍不清楚,最近的一项研究提供的证据表明,它们实际上可能会延迟微生物组的恢复。

物种之间的相互作用在许多生态系统被严重干扰后恢复中起着关键作用。通常情况下,重新种植一些重要物种对于触发一系列食物网相互作用至关重要,最终导致整个生态系统的恢复。

来自新加坡国立大学的科学家Niranjan Nagarajan及其团队利用宏基因组关联分析,确定了抗生素后肠道生态恢复的微生物决定因素。

在这项研究中,研究人员采用宏基因组关联方法来鉴定微生物物种和功能,这些微生物物种和功能可能有助于抗生素使用后微生物组的强大恢复。

该团队展示了来自多个队列的体内人类宏基因组数据如何支持一种机制模型,其通过碳水化合物降解和由所识别的特定子集触发的微生物交叉进食促进肠道微生物组的恢复。

他们在小鼠模型中的验证实验中证明,在抗生素治疗后,与恢复相关的菌种RABs(recovery-associated bacterial species)如何协同提供超过100倍的能力促进微生物绝对丰度和较高的多样性。

因此,使用RABs的高阶组合的系统研究可以帮助我们理解它们之间的相互作用,这可能有助于肠道微生物组的复杂生态过程恢复。

结果

与肠道微生物组恢复相关的微生物类群的鲁棒辨识。

为了鉴定与肠道微生物组恢复相关的微生物标志物,研究人员组装并系统地分析了来自4个队列的纵向数据, 总共117个人,大于500个样本。

这些队列代表来自三大洲,新加坡、加拿大、英格兰和瑞典4个国家,年龄范围在21-81岁,使用不同类别的抗生素,使我们能够推断与微生物组恢复相关的常见因素(表1)。

CohortNumber of   individuals/samplesSequencingAge rangeAntibiotics used
Singapore (SG)27/129Shotgun metagenomic32-81Primarily co-amoxiclav and clarithromycin
Canada (CA)4/72Shotgun metagenomic21-35Cefprozil
England (EN)37/21916S rRNA24-26Amoxicillin
Sweden (SW)29/17316S rRNA22-30Clindamycin/ciprofloxacin
NUH24/72Shotgun metagenomic23-40Co-amoxiclav

表1

来自新加坡队列的数据是新生成和分析的,74个深度鸟枪测序样本;平均大于80M reads,主要涉及接受住院抗生素治疗的老年人。

对每个队列进行独立分析,以解释队列特异性偏差,并使用跨队列验证方法对结果进行汇总,希望至少从2个队列中识别那些仅仅与恢复相关的微生物。

为了根据个体的恢复状况对个体进行分层,研究人员注意到许多个体表现出肠道微生物多样性的U形轮廓,在抗生素治疗期间多样性显着下降,但在治疗后时点恢复多样性('恢复者',图1a)。

20200826A.jpg图1

然而,即使在抗生素使用三个月后(“没恢复者”,图1a),一部分个体的肠道微生物多样性仍然较低,与多样性谱的另一端相反。

因此,研究人员根据抗生素后微生物多样性对个体进行分层,作为跨群组恢复的容易定义的无参考度量。该指标与替代定义密切相关;例如,正如预期的那样,与非恢复者相比,恢复者的抗生素后微生物组总体上与健康对照微生物组更相似(单侧Wilcoxon P<0.001;图1b,c)。

这种模式使用不同的多样性指标,跨队列一致。

恢复者和非恢复者在抗生素前状态下的微生物多样性也没有显着差异(Wilcoxon P>0.05)。

为了鉴定在微生物组恢复中起作用的微生物类群,使用两阶段方法和跨队列验证策略来提高所有时间点的关联分析的灵敏度和特异性。

总共有21个微生物物种被确定与至少2个队列中的微生物组恢复显着相关(表2),在3个队列中鉴定了10个物种,在所有4个队列中鉴定了1个物种(Bacteroides uniformis;图1d,使用数据所有时间点)。

不同群体之间的差异可能反映了饮食、环境和抗生素使用的差异,而属间水平的一致性(例如拟杆菌属物种;图1d和表2)可能反映了相关物种的功能冗余。

20200826B.jpg

表2 RABs列表

虽然一些RAB是常见的肠道细菌(例如Alistipes putredinis),已知具有宿主有益功能(例如,Faecalibacterium prausnitzii),

并且已经观察到在疾病状态(例如,B.uniformis)中被耗尽,其他的微生物组分布变化更多,对它们在肠道中的功能的理解有限,以及它们在抗生素治疗后肠道微生物组恢复中的作用尚不清楚(表2)。

恢复者和非恢复者中大多数RABs的分布表明,它们的丰度,而不是它们的存在与否,可能有助于恢复过程。

此外,由于在任何队列中,没有RABs单独区分恢复者和非恢复者,多个RABs的联合影响可能决定微生物群的成功恢复。

RABs是在不同的治疗阶段开始(抗生素治疗前、治疗期间和治疗后)进行鉴定,以捕捉在对应阶段可能有助于恢复的物种。

然后,研究人员调查了不同阶段RABs的丰度模式,并注意到虽然有些在治疗前的恢复者中含量增加了2-4倍(例如,B.uniformis),但其他的则在较晚的时间点富集,表明它们可能发挥次要作用或恢复中的协同作用(例如,F. prausnitzii),以及跨越治疗阶段的组合效应可能在恢复中发挥作用。

有趣的是,恢复者与非恢复者的肠道微生物群落中没有RABs被耗尽,表明它们没有特定的抑制作用。

对整个队列的机器学习模型进行培训表明,使用个体的抗生素前分类丰度可以在一定程度上预测抗生素后恢复状态(准确率为70.4%)

研究团队在新加坡招募了第五批健康年轻人服用抗生素(国立大学医院(NUH),表1),他们的宏基因组没有与最初的四个队列同时进行测序,以研究RABs跨队列一致性。

总体而言,21个RAB物种中有12个在新队列中显着相关(单侧Wilcoxon P<0.1),类似于四个原始队列(10-17个物种,表2),证实关联的稳健性,尽管年龄、位置和使用的抗生素不同。

此外,在跨队列关联分析中纳入第五个队列仅将RABs列表增加了2个,从而突出了该列表的一致性和可重复性。


碳水化合物降解和能量代谢途径的富集将RAB与微生物群落的生长和恢复联系起来。

为了研究RABs与微生物组恢复之间的联系,该团队系统地确定了恢复者和非恢复者治疗前和治疗期间的所有不同丰度的基因家族和途径。

该分析强调了与氨基酸,核苷酸,辅因子和细胞壁成分的生物合成有关的一组核心生长相关途径。

此外,涉及碳水化合物降解和能量产生的途径在恢复者的肠道微生物群中也显着过表达。

英国和瑞典队列治疗前和治疗期间16SRNA测序数据分析进一步证实了这些关联。

将恢复者与非恢复者丰富的两大类途径联系起来,研究人员假设,广义而言,RABs中较高的碳水化合物代谢能力可以实现更好的营养收获,从而增强生物合成和微生物生长,并随后恢复肠道微生物多样性和生物量。

研究观察到,在抗生素治疗的所有阶段,恢复者总体上表现出比非恢复者更高的微生物群落生长速率。

此外,RABs的治疗前和治疗期间丰度与个体间治疗后微生物群体生长率具有显着更高的相关性。

总之,这些分析一致地将RABs的富集,碳水化合物降解潜力,微生物群落生长速率和微生物组恢复联系在一起,作为RABs促进恢复的合理机制的连贯步骤。


特定的碳水化合物降解功能定义了RABs在肠道微生物食物网中的作用。

为了研究这一点,Nagarajan团队根据底物特异性酶拷贝数的全基因组图谱,对137个细菌基因组进行了聚类,以获得5个不同的簇。

有趣的是,RABs主要聚集在五个簇群中的两个簇群中,其中簇1中含有丰富的宿主衍生(粘蛋白)以及饮食衍生(植物和动物)碳水化合物降解酶的基因组。

降解粘蛋白的能力是肠道细菌定植的关键,并且可以帮助一些RABs的恢复过程。

虽然少数RABs属于簇2,其特征在于饮食衍生的(植物和动物)碳水化合物降解酶,但簇3,4和5(分别为淀粉,真菌碳水化合物和肽聚糖降解)很少有表现,突出特定碳水化合物降解过程在微生物群恢复中的重要性。

许多自然生态系统的恢复是由生态学相互作用驱动的,研究人员假设RABs与肠道微生物组的其他成分之间交叉进食的类似“食物网”对于微生物组的恢复是重要的。

团队开发了一种基于关联规则挖掘的数据驱动方法,来识别肠道微生物组(A→B)中细菌之间的依赖关系,其中物种B的存在似乎是有条件的关于物种A的存在(但反之亦然)。

由此产生的网络包含1166个定向边缘,连接266种细菌物种,直接从肠道微生物组数据中识别,并概括了几种已知的交叉进食相互作用。

(例如,拟杆菌属物种和Clostridium coccoides组物种)。在细菌食物网中注意到,一些物种大多有传出的边缘,表明它们对于其他物种的存在是必不可少的,而许多物种大多有进入的边缘,突出显示他们依赖于许多其他物种的存在。

在此基础上,根据出射到输入边缘的差异(从下到上)对物种进行排序,将网络可视化,显示出金字塔形的web结构(RABs节点高亮显示,图3a)。

20200826C.jpg

图3a.

有趣的是,属于簇1并且相应地富含粘蛋白降解酶的许多RAB聚集在该网络的底部三分之一(表示为初级物种)。

在网络的中间三分之一(第二级物种)中未发现RABs,而网络前三分之一中的RABs属于一组不同的CAZyme簇(第三级物种)。

这些观察结果与生态学预期一致,即虽然一些RABs应该是触发再繁殖效应(主要物种)必不可少的关键物种,但其他RABs在后期阶段发挥协同作用或作为生态恢复的指示物种(第三种)。

20200826D.jpg

图3b.

总体而言,RABs的碳水化合物降解曲线及其在食物网中的组织与模型(图3b)一致,其中:

(i)初级RABs利用其粘蛋白降解能力成功地定殖、重新定殖肠上皮细胞;一些初级RABs还担任分解复杂饮食衍生碳水化合物(例如B.uniformis)的专家,

(ii)这有助于启动一系列交叉进食相互作用,支持其他细菌(二级或三级物种)的再增殖,这些细菌不能降解粘蛋白,和/或依赖于复合碳水化合物分解成简单的糖,

(iii)随着微生物群落的重新繁殖,一些RABs(例如F.prausnitzii和Roseburia物种)有助于产生短链脂肪酸,从而为结肠细胞提供能量,以及

(iv)由此产生的粘蛋白产量增加创造了一个积极的反馈循环,推动微生物量的更快恢复。

总体效果是在肠道微生物生态系统中重建食物网以同时支持多样化社区,并且不同于其他环境中描述的微生物演替过程。


微生物组恢复的小鼠模型概括了体内一级和三级RAB之间的协同作用。

为了研究RABs之间的协同相互作用,使用基因组规模代谢网络模型来评估共培养对各种物种的益处。

总体而言,观察到RABs彼此获得比来自其他非RAB物种更大的代谢支持(Wilcoxon P<0.001)。

特别是,B.ado lescentis,Ruminococcus bromii和Alistipes shahii等第三级RABs可以从其他几个物种中获得代谢益处,包括初级RAB B.thetaiotaomicron。

为了研究体内潜在的协同作用和因果关系,我们使用抗生素治疗后生理相关的微生物组恢复小鼠模型。

具体而言,常规健康小鼠,C57BL/6J,正常肠道发育,粘蛋白产物,给予抗生素5天,然后随机分配到四个不同组以研究病例对照环境中的治疗效果:

口服灌胃:初级RAB物种 B.thetaiotaomicron(Bt);第三级RAB物种B.adolescen tis(Ba);B.thetaiotaomicron和B.adolescentis(Bt+Ba)的组合;

   和磷酸盐缓冲盐水(PBS)培养基(载体)。

然后通过每3天收集粪便样品并用鸟枪宏基因组测序分析微生物组(9个时间点和每组2-6个笼子,每个笼子2只小鼠),在22天的时间内监测恢复情况。

正如预期的那样,所有治疗组在抗生素治疗后表现出a>3-log的微生物生物量减少。

从灌胃后一天(第7天)开始,并且在灌胃后四天(第10天)更明显,与PBS相比,Bt和Bt+Ba组显示出显着增强的生物量恢复率(>100×;不包括灌胃物种)。

虽然Bt和Bt+Ba组在第10天达到抗生素前水平的微生物生物量,但在第22天,PBS和Ba组的生物量继续低于抗生素前水平。增强的恢复也与成功的定植有关,这是基于与来自对照管饲法(芽孢杆菌属;补充图9)的基因组数据的比较证实的。

有趣的是,Bt+Ba组在第19天和第22天在恢复更高的微生物组多样性方面与其他治疗组不同。这也伴随着在Bt+Ba与Bt组相比在第22天更类似于抗生素前微生物组的社区的重建。这些结果强调,虽然Bt灌胃和定植足以进行生物量恢复,而单独的Ba灌胃则不然,但Bt和Ba的组合以协同方式促进生物量和多样性恢复。正如在人类队列中观察到的那样,Bt和Bt+B a组的恢复过程与粘蛋白的富集以及饮食中的碳水化合物降解途径(但不是肽聚糖降解,作为对照)有关(图4d–f)。


讨论

跨组群分析是解释个体研究中混杂效应的一种有效方法,能够识别出与微生物组恢复一致的相关性,尽管队列特征(如抗生素使用和患者人口统计)存在差异。

本研究中确定的细菌种类和功能提供了数据驱动的观点,说明共享微生物因子如何促进全球不同人群的肠道微生物群恢复,突出了数据共享和再分析的价值。

该研究结果强调了从饮食中获取能量的核心作用,以及通过降解支撑生态恢复的关键物种(主要RABs)中的粘蛋白来定殖宿主的能力,将关键微生物群功能的恢复与生物量和多样性的生态恢复联系起来。

其他因素如抗生素耐药性可能以时间和背景依赖的方式促成这一过程。

由于环境因素强烈影响肠道微生物群,对个体重要的特定关键特性可能会因宿主和饮食因素而进一步变化。

这里使用的分析方法可以在更大的队列中发现这些,有助于训练抗生素和环境特定的机器学习模型来预测微生物的恢复。

预计这类模型将具有临床实用性,尤其是对于高危老年人或癌症患者,以指导有针对性的干预策略,减轻抗生素对肠道微生物的影响。

从这项研究中得出的另一个观点是通过益生元效应促进RABs和微生物组恢复的潜力,特别是因为很少有RABs像益生菌一样。

许多已知的RAB是专业的碳水化合物发酵体(例如果胶),高纤维/低脂饮食可以帮助选择和扩展它们。

例如Ridaura等人确定了三种RAB(B.uniformis,B.taiotaimicron和A.putredinis),有“瘦型微生物”的可移植特征,移植依赖于高纤维饮食。

类似地,果胶的补充可以促进类杆菌门的种类,同时改善肠道屏障功能,以及更稳定的粪便微生物群移植。

最后,不同的低聚糖可以促进几种丁酸盐产生的RABs的生长(表2),这是通过减少宿主炎症和增加粘蛋白产量来促进微生物群落恢复的途径。

总的来说,生态学理论认为生态系统的恢复是一个复杂的、多步骤的过程,由许多物种之间的相互作用决定。

代谢模型尤其有助于进一步探索不同碳水化合物降解基因和过程对微生物群恢复的贡献,特别是对于许多难以培养或基因改造的厌氧细菌。

还需要进一步的临床研究,包括详细的饮食信息或控制饮食,以评估饮食及其与RABs和CAZymes在微生物恢复中的作用。

美格生物在微生物领域探索多年,有着丰富的经验,希望在与同行的交流合作中发掘更多的亮点。

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参考文献

Metagenome-wide association analysis identifies microbial determinants of post-antibiotic ecological recovery in the gut

Kern Rei Chng, Tarini Shankar Ghosh, Yi Han Tan, Tannistha Nandi, Ivor Russel Lee, Amanda Hui Qi Ng, Chenhao Li, Aarthi Ravikrishnan, Kar Mun Lim, David Lye, Timothy Barkham, Karthik Raman, Swaine L. Chen, Louis Chai, Barnaby Young, Yunn-Hwen Gan & Niranjan Nagarajan