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美格生物Magigen

领先的POCT、IVD分子检测技术提供商

BiFC与蛋白质相互作用

蛋白质相互作用高通量筛选和检测服务BiFC

BiFC,bimolecular fluorescence complementation,双分子荧光互补技术,是一种快捷、直观地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。

BIFC巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白进行融合表达,如果荧光蛋白活性恢复则表明两个目标蛋白发生了相互作用。

广州美格生物在蛋白质研究领域拥有国际一流的研究团队,拥有独立的BIFC专利和丰硕的研究成果。

应用领域:

√ 高通量筛选蛋白质相互作用

√ 检测蛋白质相互作用及其亚细胞定位

√ 筛选和鉴别酶-底物复合物

√ 筛选相互作用配偶体

√ 翻译后修饰的蛋白质组学研究

√ 筛选和检测SUMO与蛋白底物的共价及非共价结合

√ 筛选病原蛋白和宿主蛋白相互作用

√ 信号传导的级联机制和细胞信号调控网络


技术原理

白质在细胞中往往不是独立完成其功能,而是通常与其他蛋白质相互作用形复物,从而在特定的时间和空间内完成特定的功能。了解蛋白质间的相互作用,特别是大规模高通量地筛选蛋白质间的相互作用,进而描绘出蛋白间相互作用的网络图谱,对揭示一个蛋白质的功能和最终阐明细胞中各种生命活动的分子机制有无可取代的重要意义。

   蛋白质片段互补技术(proteincomplementation assay, PCA) 是一种直观、快速地分析在活细胞中蛋白质之间相互作用及定位的新技术。该方法的机理如下: 结构完整的蛋白质才能实现其功能。然而,当将功能蛋白分割分成了 N C端两半时,任何一半均不能单独发挥作用,但若在空间上距离足够近就可以互补恢复原有功能。将NC端两个不具有活性的片段分别与目标蛋白连接,如果两个目标蛋白有相互作用,就使得被分割的功能蛋白的两个片段在空间上相互靠近并重新形成有功能活性的蛋白,通过检测活性即可判断目标蛋白是否发生相互作用。本公司根据不同实验的需要,用于PCA的功能蛋白有荧光素酶和荧光蛋白等。


特点与优势


本公司的PCA文库包括了近两万个人类蛋白,可以高速便捷地筛选人类细胞中的蛋白互作,也可以筛选病原蛋白与人类宿主蛋白之间的互作。本公司以蛋白质片段互补技术为基础高通量筛选蛋白质间相互作用,有如下特点和优点:

1、在活细胞中直接、原位检测蛋白质间相互作用。

2、灵敏度高,足以检测与内源性表达水平相当的蛋白质间相互作用。

3、能检测到短暂的,间接的蛋白质间相互作用。

4、自主研发的生物信息学软件,方便快捷地分析结果和绘制蛋白相互作用网络图谱。

技术步骤

1. 将待测基因克隆入含功能蛋白N端的表达载体构建诱饵质粒;

2. 将诱饵质粒转化细胞,选择被转化的细胞

3. 再将文库质粒(含18000个人类基因,已克隆入含功能蛋白C端的表达载体)转化到表达诱饵质粒的细胞中;

4. 通过流式细胞仪或荧光素酶报告系统高通量筛选和鉴定与诱饵相互作用的蛋白。

5. 生物信息学分析结果,给出与诱饵蛋白相互作用的蛋白列表。

6.提交实验报告(包括实验操作流程,数据、图表),提交与诱饵蛋白相互作用的蛋白列表。

7.(可选)通过两两之间相互作用的PCA细胞免疫荧光或免疫共沉淀进一步验证与诱饵相互作用的蛋白。


在显微镜下观测蛋白    无相互作用       有相互作用

对在细胞内的相互作用   在流式细胞仪检测蛋白对的相互作用

技术应用实例

Pilot screen for AKT1-interactionpartners

Ding Z et al. PNAS2006;103:15014-15019

Pilotscreen for AKT1-interaction partners. (A) AKT1 interaction with PDK1demonstrated by PCA. IFPN-AKT1 HeLa Tet-on cells stably transfected tocoexpress PDK1-IFPC yielded highly fluorescent cells with enhanced fluorescenceat the cell membrane and points of cell–cell contact. Inhibition of PI3K withLY294002 (20 μM) for 3 hr abrogated membrane localization. (B) Selected RePCAclones with different fluorescent patterns. Expanded clones were assessed forfluorescence after doxycycline induction. The target genes activated in eachclone are shown under each image. (C) SSB clone showing nuclear fluorescence.(D) SLC3A2 clone showing membrane fluorescence

Screen human Ras-interactingproteins in live mammalian cells using PCA

Zheng ZY, et al. Oncogene 201231(43):4630-4638

CHMP6and VPS4A are novel H-Ras binding proteins. (a) HT1080 cells expressingYn-H-Ras(12V) and either Yc-tagged CHMP6 or VPS4A, together with CFP-taggedGalT, Rab5A, Rab7A, or Rab11A, which mark Golgi, early (E.) endosomes, late(L.) endosomes/MVBs, or recycling (R.) endosomes, respectively, were analyzedby confocal microscopy. CFP and the reconstituted YFP signals werepseudo-colored red and green. Dotted lines mark the cell boundaries. Insets arescaled up images to better show co-localization between the CFP and YFPsignals.


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