CRISPR Cas14—基因编辑和分子诊断最小的成员

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Jennifer Doudna的团队发现CRISPR相关蛋白14 (CRISPR Cas14蛋白)，几乎只在嗜极古菌的超级门中发现。CRISPR Cas14蛋白具有靶向单链ssDNA的活性，且它比CRISPR Cas9蛋白小两倍；将CRISPR Cas14蛋白的非特异性ssDNase裂解活性与等温扩增方法(DETECTR-Cas14)相结合，它也有希望开发用于高保真DNA单核苷酸多态性基因分型，检测ssDNA病毒，具有潜在的临床、生态和经济的重要性。因此，CRISPR- cas14可能在传染性和非传染性疾病的CRISPR诊断领域发挥巨大作用。

CRISPR-Cas14在许多方面都是****的：

CRISPR Cas14a蛋白组装复合物的RNA质量分别为48%，CRISPR Cas9蛋白和Cas12a蛋白分别为17%和8%。RNA在CRISPR Cas14a蛋白结构中扮演着重要的角色。

CRISPR Cas14a蛋白不需要识别底物DNA里的PAM位点，而CRISPR Cas9蛋白需要识别富含G的PAM，CRISPR Cas12a蛋白需要识别富含T的PAM。

CRISPR Cas14a蛋白是最小的RNA介导的cas蛋白，为~400-700aa, 是cas9蛋白（~950-1400aa）的一半。

CRISPR Cas14a蛋白识别切割单链DNA（ssDNA），具有很高的保真度。与Cas12a蛋白类似，在特异性切割ssDNA后，其附属切割活性被激活，由此活性开发了DETECTR检测方法。

图1. CRISPR-Cas14a对单链DNA具有顺式切割和反式切割活性。(A) Cas14a,Cas9和Cas12a蛋白的结构域。(B)与目标单链DNA (ssDNA)结合的Cas14a核糖核蛋白及其在ssDNA底物上的顺式切割活性。(C)Cas14/gRNA/ssDNA激活剂的三联体复合物，对ssDNA-荧光团猝灭剂(FQ)报告基因进行反式裂解并发射荧光信号。

图2. 用于高保真ssDNA检测的DETECTR-Cas14检测技术。

(A)硫代磷酸(PT)扩增和荧光团猝灭(FQ)检测CRISPR Cas14a蛋白的ssDNA。 为了直接从临床样本中检测病毒核酸，DETECTOR-Cas14系统可以结合HUDSON方法来消除核酸的提取和纯化过程。

(C)在不需要PAM序列的情况下，高保真检测DNA单核苷酸多态性(SNP)。 针对蓝眼SNP的sgRNA可以区分人唾液DNA中的褐眼SNP。

表1. 基于CRISPR/ cas的诊断应用技术的主要特点

HOLMES, one-hour low-cost multipurpose highly efficient system; DETECTR; DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter; SHERLOCK, specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking; CAS-EXPAR, CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction; PCR, polymerase chain reaction; RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction; RPA, recombinase polymerase amplification; LAMP, loop-mediated isothermal amplification; aM, attomole/L; zM, zeptomole/L; SNP, single nucleotide polymorphism.

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