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基于CRISPR-Cas12的新冠病毒快速等温检测技术

作者:Charles Y. Chiu来源:nature

近日,来自美国加州大学的Charles Y. Chiu及同事开发了一种基于CRISPR-Cas12的快速检测SARS-CoV-2的方法,该方法称为针对SARS-CoV-2病毒的DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)的病毒传感器。

该方法使用环介导等温扩增RT-LAMP技术,对从鼻咽或口咽拭子中提取的RNA进行反转录和等温扩增,然后利用Cas12检测设定的冠状病毒序列。

研究人员首先设计了针对SARS-CoV-2的包膜E和核蛋白N的引物(图1a)。

引物扩增区与世界卫生组织WHO测定的E基因区域和美国CDC测定的N基因中的N2区域重叠,但经过修改以满足LAMP的设计要求。

没有针对美国CDC分析使用的N1和N3区域,因为这些区域缺乏适合Cas12先导RNA(gRNA)的位点。

接下来,研究人员设计了Cas12 gRNA来检测在E基因中的三种新冠病毒SARS-CoV-2,bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV,特异性地仅检测到N基因中的SARS-CoV-2。

该设计类似于WHO和美国CDC分析所使用的设计,其使用多个扩增子,携带对SARS-CoV-2有特异性或能够鉴定相关SARS类似冠状病毒的探针。

在无核酸酶的水中,利用合成的体外转录SARS-CoV-2 RNA基因靶标,这个基于CRISPR-Cas12的检测可以区分与采用E基因gRNA的相关新冠病毒没有交叉反应的SARS-CoV-2,与预期跟E基因gRNA有交叉反应的SARS-CoV-2。

然后,实验优化了针对E基因的SARS-CoV-2 的病毒传感器DETECTR,N基因和人RNase P基因作为对照,构成了 62°C、持续20-39分钟的RT–LAMP反应,Cas12检测反应在37°C,持续10分钟。

DETECTR检测运行大约30-40分钟,在侧流条上显示出结果(图1c,d)。

如果E和N基因都可以检测到,则SARS-CoV-2 DETECTR测定被认为是阳性的,如果E或N基因有一个被检测到,则有可能是阳性(图1e)。

这种解释与目前美国FDA EUA指南一致。

使用FAM-生物素报告分子和设计用于捕获标记的核酸的侧向流动条,实现了Cas12检测反应的可视化。

未切割的报告分子在第一条检测线(对照线)处被捕获,而随意的Cas12切割活动在第二条检测线(测试线)处产生信号。

为了比较使用荧光或侧流时Cas12产生的信号,采用了RT–LAMP等温扩增反应,利用5-fM or 0-fM IVT模板,N基因引物,使用荧光读数器监测相同扩增子上Cas12的性能,利用侧流条观察在 0, 2.5, 5和10分钟时的反应。

在1分钟内就检测到Cas12荧光信号,在5分钟内就显示了侧流信号。

研究人员比较了RT-LAMP/Cas12-DETECTR荧光检测的分析检测限LoD。

与美国CDC qRT-PCR分析相比,DETECTR侧流分析可以轻松显示是否有病毒的存在。

由加利福尼亚公共卫生部测试的CDC测定的估计LoD为每μl反应1个拷贝,这与美国FDA包装说明书中的分析性能一致,而DETECTR测定为每μl反应10个拷贝。

然后,研究人员评估了RT-LAMP检测直接从原始样品中扩增SARS-CoV-2核酸的能力,这些原始样品来自无症状患者的鼻咽拭子,这些样本置于UTM或磷酸盐缓冲盐水中,并加入SARS-CoV-2 IVT靶向RNA。

在≥10%UTM和≥10%磷酸盐缓冲盐水反应浓度下,测定性能降低,预计的LoD分别降至15000和500拷贝/μl。

接下来使用基于荧光和侧向流动条读数的SARS-CoV-2 DETECTR, 测试了来自6例PCR阳性COVID-19患者的11份呼吸道拭子样本中提取的RNA,和5例来自流感患者和常见人类季节性冠状病毒感染的12个鼻咽拭子样品提取的RNA。

在11个COVID19患者拭子中的9个中检测到SARS-CoV-2,并且没有与其他呼吸道病毒交叉反应。来自COVID-19患者的两个阴性拭子被证实病毒含量低于规定的LoD。

鉴于侧流和基于荧光的读数之间的高度一致性,采用荧光读数,研究人员使用DETECTR测定法,盲测来自SARS-CoV-2染患者的另外60个鼻咽拭子样品。

在60个样本中,有30个通过qRT-PCR检测,COVID-19呈阳性,有30个COVID-19呈阴性。

相对于CDC qRT-PCR检测,SARS-CoV-2 DETECTR的阳性和阴性一致性分别为95%和100%。

DETECTR分析具有与qRT-PCR相当的准确性。

然而,与qRT-PCR相比,DETECTR方法的优势包括等温信号放大,无需热循环,快速,单核苷酸靶标特异性,易于使用,无需复杂的实验室设备。

目前比较常用的恒温扩增技术除了LAMP外,还有twist RPA, Magigen RDA技术。随着等温扩增技术的日益成熟,越来越多的等温技术产品进入临床应用。

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参考文献

CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2

James P. Broughton, Xianding Deng, Guixia Yu, Clare L. Fasching, Venice Servellita, Jasmeet Singh, Xin Miao, Jessica A. Streithorst, Andrea Granados, Alicia Sotomayor-Gonzalez, Kelsey Zorn, Allan Gopez, Elaine Hsu, Wei Gu, Steve Miller, Chao-Yang Pan, Hugo Guevara, Debra A. Wadford, Janice S. Chen & Charles Y. Chiu


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