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新生儿早期关键因素对儿童肠道微生物群的持续影响

来源:nature作者:Silvia Gschwendtner

人类肠道微生物群可以激发许多对健康至关重要的功能,包括免疫系统的培养、形成抵御病原体的屏障和消化难消化的营养物质等等。

肠道菌群的变化与急性和慢性炎症、过敏或免疫失调相关疾病的发展有关,因此,肠道菌群成为新的预防性治疗策略的潜在目标。

肠道定植始于婴儿出生时,是微生物从母亲转移到婴儿身上的结果。

除了转移的母体肠道菌群外,自然分娩新生儿的肠道有来自母体阴道的细菌,而剖腹产的婴儿有来自母体皮肤和医院环境的肠道菌群。

母乳喂养是第一个被认为能刺激高度多样化微生物群发展的来源,低聚糖是母乳的一部分,能促进有益细菌的生长。

在随后的几年里,肠道微生物群逐渐发展其结构和功能。这里有许多主要的驱动因素,除了遗传倾向,还有食物质量、污染物和药物。

抗生素治疗可能会干扰自然的发展过程,有益的微生物可能会被病原体和致病菌所取代。

由于肠道菌群对人类健康的重要性,在儿童时期,有必要为儿童制定控制肠道菌群发育的策略。

为了实现这一目标,需要详细了解早期生命关键因素对肠道微生物组分的长期影响。

然而,到目前为止,大多数研究只集中在婴儿早期,关于儿童期肠道微生物群长期发育的数据也缺失。

我们的目的是研究早期生命关键因素在儿童期肠道微生物群长期发育中的作用,这些因素与后期健康有关,例如孕期母亲吸烟、分娩方式、母乳喂养、婴儿期抗生素治疗、性别和社会经济状况等。确定几个早期生命决定因素与Lisa出生队列中6岁儿童肠道微生物组分之间的关系。

因此,我们着重研究新生儿早期关键因素对肠道微生态系统长期发育的作用,这些因素与后期健康(例如孕期母亲吸烟、分娩方式、母乳喂养、婴儿期抗生素治疗、性别和社会经济状况)有关。

我们对年龄是6岁的德国出生儿童队列进行随访,旨在调查生活方式因素对免疫系统发育和过敏的影响。

新生儿早期关键因素对肠道微生物组分的影响

我们采用16S rRNA测序技术,对166份粪便样品进行了细菌多样性分析。

我们共获得18599243个原始读取。通过DADA2,对数据进行质量筛选和嵌合体去除后,保留部分16srRNA基因序列,这些序列被分配给特异的扩增子序列变异ASV。

为了排除潜在的污染物,在提取和PCR过程中发生的所有15种ASV均从数据集中移除。

为了比较没有统计偏差的样本,执行了4918次读取的子采样,反映每个样本获得的最低读取数。

稀疏分析表明多样性覆盖率大于99%,有足够的采样深度供进一步分析。通过计算丰富度、均匀度、香农指数和辛普森指数,确定每个早期生命关键亚组肠道微生物组的α多样性。

总体而言,所有多样性指数均未受到早期生活关键因素的显著影响(除了纯母乳喂养显著降低了均匀度,p=0.047)。

进一步多元方差分析表明,早期生活关键因素均未显著影响β肠道微生物组分的多样性(图1)。

20190913.jpg

图一

AB: 抗生素使用       eBF:纯母乳喂养    Smoking:孕期吸烟  

C-section: 剖腹产        Gender: 男女性别        SES: 社会经济状况 

探讨

尽管许多研究调查了不同生活方式因素对婴儿早期肠道微生物群的影响,但关于可持续影响长达6年的数据仍然缺乏。

本研究旨在探讨早期生命关键因素(例如孕期吸烟、分娩方式、母乳喂养、婴儿早期抗生素治疗、性别和社会经济状况)对6岁儿童肠道菌群结构的长期影响。

我们的结果显示早期生命关键因素对肠道微生物组的总体组成(α和β多样性)没有影响。

这与有的研究相反,有的报告说,喂养方式显著影响婴儿的微生物肠道多样性。

对整个肠道微生物群的没有长期影响,这与之前的一项研究一致,该研究说,31个月后,儿童肠道微生物发展达到稳定阶段。

虽然肠道菌群的α和β多样性不受所调查因素的影响,但单属和ASV受显著影响,主要受喂养方式和抗生素使用的影响。

母乳具有益生元功能,是决定婴儿肠道微生物群落组成的关键因素之一。

母乳低聚糖HMO只在小肠中被部分消化,大部分到达结肠,在结肠中催化发酵为短链脂肪酸SCFA。

SCFA强烈触发细菌与肠上皮的相互作用。特别是双歧杆菌,被认为是人类肠道的重要有益细菌,会触发HMO发酵,因此可以假设与的婴儿母乳喂养正相关。

在我们的属和ASV 水平的研究中,双歧杆菌的成员都受到eBF的负面影响。

在本研究中,除喂养活动外,一至二岁的抗生素处理显著影响双歧杆菌属的相对丰度和ASV水平。

令人惊讶的是,抗生素的使用导致双歧杆菌属和双歧杆菌相关的ASV20的丰度更高,这与先前在学龄前儿童和成人中的报告相反,这表明双歧杆菌属对抗生素非常敏感。

然而,Vatanen等人在婴儿中观察到双歧杆菌的抗生素敏感性是种特异性的:例如,双歧杆菌、青春期双歧杆菌和牙本质双歧杆菌的相对丰度在抗生素治疗后降低,

而短双歧杆菌和长双歧杆菌则未受影响。这表明,在抗生素耗尽后,某些双歧杆菌比其他细菌更容易受到其他微生物的竞争。

这很可能是由于对某些抗生素的剂量和/或物种特异性抗性所致。例如,一些伪卡氏杆菌菌株对四环素具有抗性,因为它们具有保护核糖体免受抗菌素效应影响的tet基因。

这意味着不同类型的抗生素对肠道微生物组分的作用不同。由于在我们的队列中没有关于抗生素类型和剂量的详细信息,因此在这里不可能解释双歧杆菌属的某些物种的持久性的作用方式。

与双歧杆菌相似,厌氧菌的相对丰度在属和ASV水平上也与抗生素有关。

这与芬兰的一项队列研究结果相矛盾,在该研究中,在过去6个月内暴露于大环内酯抗生素的学龄前儿童的厌氧菌数量减少。

然而,抗生素对Aeaerostipes 相对丰度的影响可能不同,一方面,由于暴露的时间点不同:芬兰队列研究的儿童在6个月前暴露于抗生素,而当前研究的儿童在4到5年内暴露于抗生素。

然而,抗生素对Aeaerostipes 相对丰度的影响可能不同,一方面,由于暴露的时间点不同:芬兰队列研究的儿童在6个月前暴露于抗生素,而当前研究的儿童在4到5年内暴露于抗生素。抗生素治疗和取样之间的长时间间隔可能导致混杂因素的更高影响,例如最近使用抗生素、饮食、儿童感染和其他生活条件,这些因素可能对目前的结果产生很大影响。

另一方面,两项研究的抗体类型和剂量可能有所不同。治疗和取样之间的长时间间隔可能导致混杂因素的更高影响,例如最近使用抗生素、饮食、儿童感染和其他生活条件,这些因素可能对目前的结果产生很大影响。

值得注意的是,粪便细菌的成分对本研究中所有被调查的早期生命关键因素都有反应。

无烟、阴道分娩和高SES被认为是有益的,它们在属和ASV水平上增加了粪便细菌的相对丰度。

与双歧杆菌相似,粪便杆菌与纯母乳喂养呈负相关,但与抗生素使用呈正相关。

第一个发现与Thompson等人的研究结果一致,他们观察到非纯母乳喂养婴儿的粪便中也有较高的相对丰度。

此外,丹麦的一项队列研究结果表明,母乳喂养对3岁儿童肠道菌群中的普氏菌定植没有显著影响。

抗生素治疗与粪便细菌相对丰度的反比关系可能是由于对某些抗生素的耐受性。

根据Foditsch等人的研究,从小牛和仔猪粪便样本中分离到的大多数普拉斯尼茨菌株对环丙沙星和磺胺甲恶唑甲氧苄啶都有耐药性,大约50%的分离菌株对四环素、阿米卡星、头孢吡嗪有耐药性。

虽然动物研究的结果不能代表人类,但潜在的抗生素抗性会增加粪便细菌对抗生素处理婴儿其他肠道微生物的竞争力,从而解释其相对丰度的增加。

本研究的优势在于前瞻性地收集了纵向LISA出生队列研究中,早期生命关键因素的信息。   

因此,回忆偏差低于回顾性队列研究。

此外,人群在年龄、地区和种族上是同质的,这使肠道微生物群的个体间变异最小化。

缺乏婴儿期粪便样是本研究的局限性,因为比较婴儿期和儿童期的肠道微生物组分,可以研究早期生命决定因素在定植和稳定期间对肠道微生物组发展动态的影响。

此外,在6年的随访中没有对饮食进行全面评估,也没有关于抗生素使用历史的详细资料。

其他潜在的残余混杂因素也可能影响本研究的结果,因为本观察研究只解释了有限数量的早期生命关键因素。

然而,社会经济状况至少部分地解释了与之相关的一些生活方式因素。

此外,一些混杂因素被认为是相关的,如吸烟、低SES和母乳喂养减少。

因此,并非所有情况下都能清楚地将数据与本研究中研究的早期生命关键因素之一联系起来。

然而,对稳定后肠道微生物组分的分析表明,早期生命关键因素的影响持续了6年,尽管其影响不如其他研究报告的早期婴儿显著。

这些影响可能被其他生活方式和环境因素所改变,这些因素随着年龄的增长而变得更加重要。

早期生命因素可能对肠道微生物组分产生长期影响的机制尚不清楚。

一种可能的解释是,微生物在幼年时期定植于肠道的特定生态位。如果这些微生物由于外部刺激(如抗生素治疗)而缺失,则这些生态位将被其他微生物定殖。

一旦建立,微生物形成复杂的网络,导致一个被改变、但仍然稳定的肠道微生物群,这是只可被主要生活方式的变化而改变。

这项观察研究只可以报告相关性,并指出可能与日后健康相关的特定有机体,从而有助于早期发现处于危险中的人群。

潜在机制的鉴定超出了本研究的范围,需要精心设计和控制的动物研究,或考虑宿主表型的亚基因组方法。



研究人群与抽样

本研究基于LISA出生队列。

LISA:东西德的生活方式因素对免疫系统发育和过敏的影响

LISA出生队列研究的受试者从1997年至1999年在德国四个地区招募。

LISA研究的数据收集根据国家研究法规进行的,并得到了当地伦理委员会的批准。

所有父母或法定监护人均书面同意。

随访从2003年至2005年,从慕尼黑研究中心收集了166名6岁儿童的粪便样本。

只包括参加研究中心体检,并完成6年随访的所有问卷的参与者。

在家中收集粪便样本,并在体检期间向家属提供样本包。样品立即送至研究中心,并在-20°C下冷冻。

采样期结束后,将样品转移至-80°C下储存,直至分析。从给父母的问卷中收集有关早期生活决定因素和潜在混杂因素的信息。

本研究共分析了六个因素。本研究中包含的四个早期生命关键因素是:孕期吸烟、分娩方式、至少四个月的纯母乳喂养(eBF)和早期(一至二岁)抗生素治疗,

而两个潜在的混淆因素是性别,以及社会经济地位SES(以母亲的教育水平为代表)。


16srRNA基因扩增子测序

使用约125毫克粪便样本进行DNA提取。

提取试剂盒中的潜在DNA污染物通过使用水, 而不是粪便材料进行提取,包括阴性提取对照品进行分析。


测序处理

使用带有默认参数的2017.1136版QIIME 2软件包对序列进行分析。

使用AdapterRemoval修剪并合并fastq文件,最小读取长度为50,最小Phred分数为15。使用QIIME 2插件DADA238进行质量控制,

分别在280(正向)和220(反向)位置去除10 bp n-末端并截断读数,从而产生独特的扩增子序列变体ASV。

ASV是一种区别于错误的生物序列,允许检测测序基因上的单核苷酸差异。ASV方法比OTU方法具有更好的特异性和敏感性。


统计分析

所有统计分析均使用R版本3.5.0(https://www.r-project.org)进行。

分析的子样本集(n=166)与慕尼黑总队列(n=1298)进行比较,以使用Fisher精确检验确定数据集的代表性




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参考文献

Early life determinants induce sustainable changes in the gut microbiome of six-year-old children

Silvia Gschwendtner, Hyena Kang, Elisabeth Thiering, Susanne Kublik, Bärbel Fösel, Holger Schulz, Susanne Krauss-Etschmann, Joachim Heinrich, Anne Schöler, Michael Schloter & Marie Standl


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