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超重力扰乱小鼠肠道微生物群

作者:Corentine Alauzet

肠道微生物群是一个复杂的微生物生态系统,其平衡和稳态是由共生微生物的不断进入维持的。

人类肠道微生物群由两个主要的门(硬杆菌和拟杆菌)代表,一些次要的门主要由放线菌、变形杆菌、梭杆菌和疣微菌门成员代表。

这些类群中的大多数具有重要的生理功能,如分解纤维、刺激免疫系统和防止病原体定植。微生物群的组成既受宿主遗传学等内在因素的影响,也受药物或饮食等外在因素的影响。

越来越多的研究表明,压力,特别是慢性压力,对肠道微生物群的组成和组织有着深远的影响,这要么直接通过对肠道释放的应激介质细菌的作用,要么间接通过调节局部免疫、肠道运动或内脏知觉作用。

航天飞行是一种独特的压力模式,它处理的是心理压力(如禁闭、隔离、睡眠不足、持续的生理失调)或物理压力(如起飞和着陆时产生的超重力、整个飞行过程中出现的微重力、太阳和宇宙辐射)。使用长期超重力条件下的单因素小鼠应激模型,我们首先发现超重力增加了血清皮质酮浓度和焦虑类反应。

这些改变取决于超重力水平,因为他们在3G和4G的重力时被观察到,但在2G时没有。对于宇航员来说,尽管在太空任务前进行了预期和特殊训练,以应对身体和精神压力, 但太空飞行期间和之后都观察到了肾上腺皮质的激活和糖皮质激素压力反应路径。

有趣的是,交感神经系统,以及下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴,也强烈参与大脑-肠轴,驱动中枢神经系统和胃肠道(包括微生物群)之间的沟通。

这些通讯的调节可能影响肠道微生物群的稳定性和组成。免疫系统的失调,也可以调节肠道微生物,经常在动物和宇航员中被描述。

在超重力或微重力的地面小鼠模型中发现了B和T淋巴细胞生成的变化。

在宇航员中,细胞介导免疫的放松管制,如改变T细胞记忆亚群分布、改变细胞因子产生谱或降低迟发型超敏反应,与对抗病原微生物的防御能力受损有关。

航天飞行中遇到的许多其他因素可能会影响肠道细菌,如营养因素或辐射。此外,有研究表明,在太空飞行中微生物的行为会发生改变。

根据所研究的细菌,由于基因表达的调节,增强或降低了毒性、改变了抗菌敏感性和/或增加了生物膜的形成。

所有这些参数都可能导致航天飞行期间肠道群落的直接或间接改变。由于肠道微生物群的不平衡可能与从健康状态向患病状态的转变有关,因此评估长期太空任务中,宇航员肠道微生物群的状态以及每个参数在发育不良中的作用非常重要。

本研究利用离心机产生的2G或3G重力, 评估进行了21天禁闭的地面小鼠模型中,肠道微生物群和粘膜的变化。选择这两种超重力水平来确定仅在3G时观察到的持续性心理社会应激的潜在影响。

结果

暴露于3G超重力环境下的小鼠肠道微生物多样性显著改变。

我们将小鼠分为三组:12只小鼠用2G离心,12只小鼠用3G离心,8只用1G作为对照组置于相同的实验条件、但处于静止位置。

所有组均在21天内暴露于这些条件下,每笼4只动物。21天后,出现损伤的动物(如可能引起炎症的咬伤)被丢弃,剩下10只2G小鼠、11只3G小鼠和7只对照组(1G)。

收集每只小鼠(28个样品)的体内内容,并按照“材料与方法”中的描述,通过焦磷酸测序法和qPCR(16s rDNA定量)进行分析。

定量的盲肠内16S rDNA含量表明,3G超重力作用下小鼠的细菌负荷显著增加(图1)。

根据我们的焦磷酸测序协议,平均每个样本生成了14476次的读数,范围从8054到25136,平均长度为525 bp,范围从498到533 bp。

个别稀疏曲线(补充图s1)表明,观察到的操作分类单位OTUs的平均数量为155,范围从110到195OTU,所有样本在大约5000个序列读数下到达高值。

因此,读取覆盖率足以捕获每个胞内微生物群的大多数细菌的多样性。

20190701A.jpg

图1

qPCR对2G(n=10)或3G(n=11)超重力组和1G对照组小鼠(n=7)每mg盲肠内含量的16s rRNA编码基因拷贝总数进行量化。

使用Mann-Whitney U检验进行统计分析。框的上下范围分别代表75%和25%四分位数。误差线反映了平均值的标准误差。

20190701B.jpg图2

在3G样本中发现最大的平均多样性。与在2G和1G下重力下的小鼠相比,在3G超重力作用下,小鼠微生物群中使用的所有指标均显著增加了α-多样性(图2)。

通过主成分分析(PCA)评估的盲肠内群落之间的相似性,并未显示1G和2G微生物群之间的真正区别,同时观察到1G和3G微生物群以及2G和3G微生物群之间的明显聚类。

肠道微生物群的组成被超重力改变。

盲肠微生物群由7个分支的细菌组成。鉴定出的大多数序列属于硬壁菌门(71.8-93.3%)和拟杆菌门(2.2-26.5%)。

在3G小鼠中,与1G和2G小鼠相比,我们观察到更高水平的拟杆菌,与硬壁菌/拟杆菌比率显著降低有关(图4)。

20190701C.jpg


图4

在其他门中,我们观察到在3G时,变形杆菌成员的相对丰度显著降低,而在3G时,与1G微生物群相比,Verrucomicrobia成员的相对丰度显著增加。3G的微生物群中12.1%的类群受到显著影响,其中大多数(78%)富集。这项研究显示G-水平依赖性扰乱了细胞内微生物群,而没有改变粘膜完整性。

2G和3G超重力不影响肠道结构和局部免疫。


结论与展望

我们的研究首次探讨了超重力对盲肠内微生物群的影响,尤其是3G重力时。我们的结果与飞行实验获得的数据相似,表明离心获得的超重力是一种有用的地面鼠模型。

此外,肠道微生物群和免疫系统之间存在着深刻的联系,这突显出有必要开展研究。

事实上,太空飞行中可能出现的生物失调不仅会影响免疫系统的效率,还会影响能量摄入、营养素同化和中间代谢,如抗生素。

直到最近,这些关键问题才开始受到应有的关注。此外,在受超重力影响的细菌类群中,有些类群应仔细研究,以探讨它们在肠道内的有害或有益作用。

从这些研究中获得的数据很重要,因为它们可能会导致新的策略,如益生菌或益生菌补充或饮食方法,以对抗航天相关的失调及其对健康的影响。

这些首批数据加强了最近通过飞行试验或微重力模型获得的数据,并强调了进一步研究探索航天对肠道微生物群的影响的重要性,以优化长期太空旅行条件。


材料与方法

动物

实验程序的执行符合国家立法和欧洲共同体关于保护实验和其他科学用途动物的理事会指令(2010/63/ue)。

实验由法国研究部(授权04827)和当地伦理委员会(Comit_d'Ethique Lorrain en Mati_re d'Exp_rimentation Animale,协议编号:CELMEA-2012-0008)批准。

本研究中使用的小鼠是雄性小鼠(8周大,平均体重20g)。为了适应房间条件,它们先被安置于标准笼子,每个笼子四只老鼠,大小为36×20×14cm,为期一周,在恒定条件下(22°C,50%相对湿度,12小时光/暗循环),可自由获得标准食物和水。

离心

将含有小鼠的标准笼放在大半径离心机的吊篮中,旋转产生2G或3G的重力。将含有对照小鼠的笼放在与离心小鼠相同的吊篮中和同一房间中,但处于静止位置(1G重力),除了超重力水平外,其他所有环境变量是一样的。给老鼠提供足够三周用的食物和水,使离心机连续运转。在离心3周期间,小鼠保持原状。安装在离心机臂上的红外摄像机对老鼠进行昼夜远程监控。

第21天,停止离心机,用异氟醚麻醉实验组(1G、2G和3G)小鼠,称重,然后由颈椎脱位进行安乐死。立即对所有样品进行处理,以避免降解或污染。

样品采集

通过切除整个盲肠和结肠最近端来解剖肠。在DEPC(1‰)处理过的PBS中,纵向打开样品,通过两次连续冲洗,取出其内容。

立即将管腔内容冷冻在液氮中,并在-80°C下储存,直到细菌DNA分离。将每个样本的5毫米长的组织标本固定在4%中性福尔马林缓冲液中进行组织学分析。

将剩余的组织放入1 ml的三唑中,冷冻在液氮中,储存在-80°C,直到RNA分离。

组织学分析

样本被脱水并嵌入石蜡中。5μm石蜡切片用HES(苏木精、伊红、藏红花)染色。共检查了56例盲肠和结肠活检。对每个活检标本,评估9个组织学特征。

DNA分离

使用快速DNA试剂盒从50mg盲肠样本中提取整个基因组DNA。

使用引物对16S rRNA基因的v4-v6区域进行初始扩增

扩增子测序数据分析

利用Megan管道对扩增子测序数据进行了分析。

用RT-qPCR定量分析肠道组织中的免疫和应激标志物。

统计分析

利用Mann-Whitney U检验分析qPCR定量细菌负荷、相对丰度和系统发育多样性指数的比较,显著性水平α为0.05。



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参考文献

Hypergravity disrupts murine intestinal microbiota

Corentine Alauzet, Lisiane Cunat, Maxime Wack, Alain Lozniewski, Hélène Busby, Nelly Agrinier, Catherine Cailliez-Grimal & Jean-Pol Frippiat


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