精准肿瘤学SaCas9完全性基因敲除Cpf1完全性基因敲除    SpCas9完全性敲除      传统条件性敲除            传统完全性敲除            基因敲除小鼠传统同源重组基因敲入SaCas9基因敲入         SpCas9基因敲入        Cpf1基因敲入            基因敲入小鼠ES囊胚注射嵌合体小鼠细胞产品        转基因小鼠    定点突变        CAR-T细胞    人源蛋白质PCA筛选      验证人源蛋白质相互作用人源蛋白质PCA检测人源蛋白质两两之间相互作用的PCA检测验证人源蛋白质共定位  全基因组甲基化测序分析动植物基因组重测序      人类全基因组重测序      外显子测序                    人类基因组测序    16S/18S/ITS扩增子测序细菌基因组测序          真菌基因组测序          小基因组测序              宏基因组测序              微生物基因组测序转录组测序分析    Small RNA测序    IncRNA测序        RNA测序分析      基因芯片              小鼠胚胎及相关产品      小鼠基因型鉴定            打靶载体构建                胚胎冻存                       8细胞胚胎注射          原核/胞质注射          常规囊胚注射             显微注射                        质粒选购载体自建

咨询热线

020-80925240   34438810  18027152056

美格生物

MAGIGEN

用CRISPR技术改良番茄和其他水果作物

来源:Nature作者:Tian Wang

水果是重要营养素的主要来源,在某些地区是主要食品。不断增加的人口和气候变化使得生产高产、适应环境能力增强的水果作物成为当务之急,但传统育种不可能满足需求。

幸运的是,CRISPR基因编辑技术为水果作物改良开辟了一条新的道路,从而彻底改变了植物育种。

通过重组DNA技术获得的生物体被称为“转基因”产品GM。1994年,美国FDA批准转基因番茄Flavr Savr在美国进行商业种植。

它所含的改性使其成熟过程变慢,并防止采摘后软化。被授权销售的转基因木瓜能够抵抗环斑病毒攻击,并显示出更高的生产效率。

今天生产的夏威夷木瓜有百分之八十是转基因的,没有其他的方法可替代。

然而,新的转基因作物的开发在很大程度上受到监管审批程序的影响,这些法规也有助于确保消费者对转基因作物生物安全的信心。

因此,让新转基因作物获得批准的成本可能非常高,监管要求也可能延迟产品销售。

而CRISPR技术可能是一个更好的选择:2016年,一个CRISPR编辑的蘑菇摆脱了美国的监管,因为它不包含外来DNA,不符合转基因生物立法。

2017年,美国食品药品监督管理局批准销售一种含油量增加的亚麻荠和一种耐旱大豆,这表明经过CRISPR编辑的作物不符合传统转基因作物的严格规定,而且CRISPR技术将彻底改变作物育种的步伐。

CRISPR系统是一种复杂的适应性免疫机制,存在于细菌和古细菌中,用于防御噬菌体和外源质粒的入侵。

近十年,CRISPR-Cas成功地被设计成编辑人类、动物和植物基因组的有效工具。

其中CRISPR-CAS9系统的简单性使基因组工程取得了显著进展。

CRISPR-CAS9的作用机理

一般来说,CRISPR-CAS9系统对外来DNA入侵的反应可分为三个阶段:

(i)获取阶段,识别入侵的DNA,并将从目标DNA衍生的间隔序列插入宿主CRISPR阵列,以建立免疫记忆;

(ii)表达阶段,CAS9蛋白被表达。并将CRISPR阵列转录成前体RNA转录物(cRNA前体)。一个非编码的反式激活Crispr RNA(crRNA)然后与前crRNA和cas9蛋白杂交,     并将其加工成成熟的RNA单元,称为crRNAs;

(iii)干扰阶段,成熟的crRNA引导Cas9蛋白识别合适的DNA靶点,导致入侵的外来DNA的分裂和降解。

CAS9蛋白切割DNA产生双链断裂(DSB),触发细胞DNA修复机制(图1)。在缺乏同源修复模板的情况下,容易出错的非同源端连接NHEJ途径被激活,并在DSB位点引入随机插入/删除甚至替换,通常导致基因功能中断。或者,如果有与DSB位点周围序列同源的供体DNA模板,则启动无错误同源定向修复HDR途径,产生执行精确基因修饰的突变,包括基因敲入、缺失或突变。

目前,最常用的cas9蛋白来源于化脓性链球菌Sp。为了利用该系统进行基因组编辑,需要合成单指南RNA(sgRNAs)来构建CRISPR-CAS9表达盒。

然后,通过Watson–Crick碱基配对,利用识别NGG型原间隔序列相邻基序、并靶向DNA序列的sgRNAs将cas9蛋白引导到特定的基因组位点(图1)。

20190616.jpg

图1:CRISPR-CAS9介导的植物基因组工程机制。

通过20个核苷酸序列,sgRNA引导spCas9蛋白结合基因组DNA,并进一步引导其引入DSB。当通过易出错的NHEJ通路修复或通过无错误的HDR通路修复时,这种DSB会导致随机突变。

  名称来源功能作物种类
Cas   proteins
 St1Cas9Streptococcus   thermophilusSize is smaller;   recognizes longer PAMs (“NNAGAA” or “NNGGAA”)Arabidopsis
 SaCas9Staphylococcus aureusSize is smaller; recognizes   longer PAMs (“NNGGGT” or “NNGAA”)Arabidopsis;   tobacco
 SpCas9-VQRStreptococcus pyogenesRecognizes “NGA” PAMRice
 SpCas9-   VRERStreptococcus pyogenesRecognizes “NGCG” PAMRice
 Cas12a   (Cpf1)Acidaminococcus sp. BV3L6(As); Francisellanovicida (Fn); Lachnospiraceae bacterium ND2006 (Lb)Recognizes “TTTN” or “TTN” PAMs;   targets DNA to introduce a 5′ overhang; guided by a shorter crRNA; exhibits   little off-target activityArabidopsis;   maize; rice; soybean; tobacco
 Cas13a   (C2c2)LeptotrichiashahiiTargets single-stranded RNA with   PFS of A, U, or CRice; tobacco
 nCas9Streptococcus pyogenesCas9 nickase contains a mutation   in either of the two nuclease domains of Cas9 protein. It induces SSBsArabidopsis;   rice; tomato
 dCas9Streptococcus pyogenesDeficient Cas9 contains   mutations in both nuclease domains of Cas9 protein. without cleavage   activity. The dCas9-based regulator can be developed when fused with   transcriptional activators or repressorsArabidopsis;   maize; rice; tobacco; wheat
Promoters
Preferential expressionCrop species
Cas   promoters
 YAO
Tissues   undergoing active cell division including the shoot apical and root meristem,   embryo sac, embryo, endosperm, and pollenArabidopsis; citrus
 SPL
Sporogenous cells and   microsporocytesArabidopsis
 EC1.1/EC1.2
Egg cells and one-cell stage   embryosArabidopsis
 ICU2
Meristematic regionsArabidopsis
 EF1α, hisH4
Meristematic and reproductive   tissuesArabidopsis
 MGE
Meiosis stageArabidopsis
 DMC1
MeiocytesArabidopsis;   maize
 RPS5A
At all developmental stagesArabidopsis
Strategy

Crop species
sgRNAs
 Assemble multiple sgRNA expression cassettes   into CRISPR-Cas vectorArabidopsis; maize; Populus; rice; tobacco; tomato
 Produce numerous sgRNAs from a single   polycistronic gene via the endogenous tRNA-processing systemMaize; potato; rice; tomato;   wheat


表1植物Crispr-CAS系统优化


CRISPR-CAS9在水果作物中的应用

CRISPR-CAS9在番茄中的应用现状

2014年,CRISPR-CAS9系统首次应用于番茄。Argonaute 7 被敲除.

从那时起,许多关于CRISPR-CAS9在番茄中的应用的报告,主要分为以下四类:抗生物胁迫、抗非生物胁迫、提高番茄果实品质和驯化番茄。

抗生物应力

生物胁迫包括病毒、细菌、真菌和昆虫,它们都能攻击植物并造成损害。CRISPR-CAS9技术自2013年成功应用于获得稳定的转基因植株以来,一直被用于获得抗病植株。自那时起,CRISPR-CAS9已被用于对付病毒、真菌和细菌感染。

对于病毒,使用了两种策略。一种是设计sgRNAs,通过序列互补直接定位病毒基因组,另一种是修改具有抗病毒特性的番茄基因。

Tashkandi等人利用CRISPR-CAS9系统,通过靶向其外壳蛋白和复制酶位点,工程处理了番茄植株,以对抗黄叶卷曲病毒。转基因番茄比野生型番茄表现出高效的病毒干扰,积累的病毒基因组DNA较少。这种免疫在多代植株中保持活跃,表明CRISPR-CAS9系统在培育持久的抗病毒植物方面的作用。

CRISPR-CAS9技术也被用来敲除与抗病途径有关的关键基因,目的是测试这些基因是否具有抗病毒的免疫力。以番茄Dicer-like 2(DCL2)基因为目标,在马铃薯X病毒、烟草花叶病毒和番茄花叶病毒感染下,DCL2突变体表现出病毒症状,提示DCL2参与了对RNA病毒的防御机制。

真菌是多种疾病的罪魁祸首,霜霉病和白粉病给番茄种植造成严重的经济损失。拟南芥霜霉病抗性6(DMR6)属于2-氧戊二酸铁(II)依赖氧合酶超家族,参与水杨酸的稳态,其过度表达导致对霜霉病的敏感性增强。研究人员使用CRISPR-CAS9系统灭活了番茄中的DMR6原代志,发现DMR6突变体对各种病原体(包括丁香假单胞菌、辣椒疫霉和黄单胞菌属)具有抗病性,但没有明显的有害作用。

耐霉基因座O 1(Mlo1)编码一种膜相关蛋白,对引起白粉病的真菌具有敏感性。Nekrasov等人利用CRISPR-CAS9技术构建了番茄功能缺失的MLO1突变体,发现该突变体对白粉病真菌Oidium neolycopersici具有完全抗性。值得注意的是,通过自体T0转化体分离转移DNA(T-DNA),并在后代中鉴定出MLO1 T-DNA自由突变体,被认为是无转基因作物。

通过CRISPR-CAS9技术,有丝分裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)被证明具有抗灰霉病的能力。

由于不可检测的无症状感染和缺乏合适的农用化学品,植物病原菌很难控制,利用对这些病原体的遗传抗性是最有效的策略。丁香假单胞菌是番茄植株细菌性斑点病的病原菌,对番茄植株的生产能力和市场占有率有不利影响。由于jasmonate-zim-domain蛋白2(JAZ2)有助于防御拟南芥中的P. syringae菌,研究人员使用CRISPR-CAS9来产生番茄显性JAZ2阻遏物。这些JAZ2ΔJAS阻遏物对P. syringae有抵抗力,这表明基于CRISPR-CAS9的果品保护策略可以实际应用。

抗非生物胁迫

根据达尔文的进化理论,活下来的物种不是最聪明或最强壮的物种,而是能够适应并适应不断变化的环境的物种。传统的育种技术大大提高了作物产量,但随着粮食需求的不断增长,需要新的途径进一步提高作物产量,CRISPR-CAS9技术是最有前景的。

由于番茄是一种对低温敏感的作物,其果实品质容易因低温胁迫而受损。C-repeat结合因子1(CBF1)保护植物免受冷损伤,CRISPR-CAS9产生的CBF1突变体表现出比野生型植物更严重的冷损伤症状,电解质渗漏更高。

提高番茄果实品质

在番茄果实中,花心皮产生的子房室数对番茄果实大小影响最大,占果实增大总方差的50%。

子房室数量受多个数量性状基因座(QTL)控制,其中一些已被鉴定。

科学家利用CRISPR-CAS9技术,通过破坏典型的CLAVATA-WUSCHEL (CLV-WUS)干细胞回路,快速生产出更大的番茄果实。他们设计了8个sgRNAs靶向CLV3基因启动子区,转基因植株比野生植株产生更多的器官和更大的果实。

颜色和质地也是消费者对新鲜番茄认知的重要方面。不同地区的消费者有不同的颜色偏好。

研究人员通过分别以番茄红素合成酶1(psy1)、MYB转录因子12(MYB12)和花青素2(ANT2)为靶点,成功培育出黄色、粉色和紫色番茄。

为延长保质期而修改纹理特征一直是育种工作者面临的挑战。Crispr灭活成熟抑制剂(RIN)或DNA脱甲基酶2(DML2)可导致果实不完全成熟,保质期长。

然而,这些水果往往无法发展出完整的颜色,导致不良的风味和降低营养价值。因此,在不影响其他质量因素的情况下获得保质期良好的水果至关重要。

有两个研究小组报告了在不降低番茄感官和营养品质的情况下,通过沉默果胶裂解酶PL和晚成熟基因ALC,成功地控制水果软化,这表明crispr系统可能是水果作物改良的一个很好的工具。

在水果内部品质方面,人们努力提高营养素和生物活性化合物的含量。糖和类胡萝卜素的合成和代谢涉及到几个基因。

例如,敲除有丝分裂原激活蛋白激酶20(MPK20)会破坏在转录和蛋白质水平上控制糖代谢的几个基因的表达。

生物活性化合物是指“通常少量存在于食品中的额外营养成分”,通常在预防心血管疾病和癌症中发挥作用。花青素、苹果酸、γ-氨基丁酸(GABA)和番茄红素被认为是具有生物活性的化合物,CRISPR-CAS9技术通过调节代谢途径中关键基因的表达,来生产强型番茄果实的花青素、GABA-和番茄红素增。

利用CRISPR-CAS9,研究人员还发现了决定番茄苹果酸含量的关键基因,铝活化苹果酸转运蛋白9(ALMT9)。

番茄的驯化

植物的驯化主要影响控制植物形态(如种子大小、传播机制和植物结构)和生理(如萌发、开花和成熟的时间)的基因。

为了达到理想型,古典育种或现代“重新布线”作物育种已经将野生亲缘的等位基因引入栽培物种。然而,这些技术非常耗时。另一种策略是在基因水平上直接操纵野生作物,重新驯化它们,并利用它们对不利环境的适应。CRISPR-CAS9技术大大加快了这种新的驯化进程。

Klap等人证实在热应激条件下,agamous-like 6基因AGL6突变是单性结实的原因;由于该突变体具有正常的重量和形状,没有同源变化,因此AGL6是单性结实的一个有吸引力的基因。赤霉素或生长素信号的升高可在不受精的情况下诱导孤雌生殖。

由indole-3-acetic acid inducible 9 (IAA9)和生长素反应因子7(ARF7)基因敲除产生的突变体均参与生长素信号传导途径,产生无核果实,是单性结实番茄的特征。

关节是茎干的一个薄弱区域,它允许果实从植株上脱落。野生物种受益于果实的脱落,因为这一过程有助于种子的散播,但由于使用采摘机械手,农民更喜欢把水果挂在植物上。

育种人员一直试图获得一种突变体,这种突变体消除了花脱落区(通过该区,未受精的花或成熟的果实从植株上脱落),并提供“无缝”的果梗。Roldan等人利用CRISPR-CAS9技术,研制出功能缺失型MADS盒蛋白21(MBP21)突变株MBP21,表现出无连接表型。

与正常植物相比,矮生植物的果实更容易采摘,营养物质从根到叶的运输距离更短。矮植物在强风中也更容易存活。通过对赤霉素不敏感(GAI)基因的灭活,获得了可遗传的矮番茄植株,这些植株在多风环境中具有一定的应用价值。然而,这些矮突变体的减重和种子数问题需要首先解决。

植物生产力取决于花,而花序结构决定了花的生产。

利用CRISPR-CAS9技术对番茄叶柄叶片(BOP)基因进行沉默,检测其在拟南芥(叶片复杂度和器官脱落)中是否具有与同系物相同的功能,从而影响其花序结构。

值得注意的是,CRISPR-bop1/2/3三重突变体的开花速度比野生型快,但花序极其简化。


CRISPR-CAS9在其他水果作物上的应用现状

CRISPR-CAS9技术的使用不限于番茄。它还成功地应用于其他几种水果作物,包括草莓、香蕉、葡萄、苹果、西瓜和猕猴桃。

利用CRISPR-CAS9对生长素应答因子8(ARF8)进行定位,研究人员鉴定出ARF8纯合突变体的幼苗生长速度快于野生型植株。

番茄MADS盒基因6(TM6)在雄蕊发育中起着主导作用。为了表征其在草莓中的作用,将CRISPR-CAS9系统应用于一个八倍体品种,对TM6突变体进行表型分析,发现其花药存在严重缺陷,表明TM6在花发育中起着重要作用。此外,利用CRISPR-CAS9策略研究了YUCCA10(YUC10)在草莓果实发育过程中生长素合成中的生物学作用。当YUC10被敲除时,在YUC10突变体中观察到游离生长素显著减少。

除了草莓的功能性研究外,越来越多的研究人员正致力于CRISPR-CAS9介导的基因组编辑,以改进其他水果作物。

在这里,我们总结了CRISPR-CAS9在其他水果作物上的应用,包括以下几个方面:抗生物胁迫、抗非生物胁迫和水果作物的驯化。

抗生物应力

在热带和亚热带国家,香蕉条纹病毒是香蕉育种的一大挑战。如前所述,提高对病毒抗性的一个策略是用CRISPR-CAS9定位其基因组。

Tripathi等人利用该系统对内源性香蕉条病毒进行灭活,发现75%的受试植物与未受试植物相比无症状。

植物RNA病毒需要宿主因子,如真核细胞转化起始因子4E(eIF4E),以维持其生命周期。如果因子失活,病毒感染性就会被破坏。以CRISPR-CAS9为突变体,利用该突变体破坏了EIF4E的功能,对黄瓜静脉黄变病毒、南瓜黄花叶病毒和番木瓜环斑花叶病毒具有免疫功能。

真菌病可导致葡萄产量和葡萄浆果品质的急剧下降。已知两个基因,抗霉菌基因座O7(MLO7)和WRKY转录因子52(WRKY52)分别与白粉菌和灰霉病抗性有关。

两种功能缺失的突变体均显示免疫增强。该技术还被用于可可和木瓜,以提高对热带疫霉和棕榈疫霉的抗性。

抗非生物胁迫

田间西瓜受到杂草的严重威胁,但除草剂的使用也会影响西瓜的生长。因此,要获得抗除草剂的西瓜,这是传统育种难以实现的。

近年来,Crispr介导的单核苷酸转化已被用于抗除草剂水稻的开发。

为了引入新的西瓜基地编辑系统,科学家选定了乙酰乳酸合成酶(ALS),一个点突变形成的高水平的除草剂抗性的基因。

用除草剂苯磺隆处理无转基因的ALS突变体和野生型植株,虽然所有的野生型植株都受到严重的破坏,但ALS突变体没有受到影响,这表明成功地建立了一个CRISPR碱基编辑系统和抗除草剂西瓜。

水果作物的驯化

Lemmon等人驯化了一种孤儿作物,地樱桃,一种生长在中美洲和南美洲的野生茄科植物。利用CRISPR-CAS9,将三种分别控制植物结构、花卉生产和果实大小的番茄同源基因self-pruning (SP)、SP5G和CLV1)引入地樱桃,从而改善了地樱桃的主要生产特性。

猕猴桃是一种新近驯化的水果作物,通过灭活centroradialis 4(CEN4)和CEN(已被证实是抑制开花的物质),将原始的攀缘木本多年生植物转化为紧凑的植株,最终获得快速的花和果实发育。

结束语

CRISPR-CAS9技术自2013年首次应用以来,已经彻底改变了作物育种。主要突破是抗病和环境适应性果品的产生,以及果品质量的提高。

2016年4月,美国食品和药物管理局表示,经过crispr编辑的蘑菇可以在没有监督的情况下进入市场,使其成为第一个获得美国政府授权的CRISPR编辑生物。

然而,经过CRISPR编辑的作物的增长面临着社会政治挑战,包括公众接受度和政府监管。

虽然由CRISPR-CAS9编辑的无转基因生物目前在美国没有受到管制,但中国和日本仍在讨论是否管理CRISPR技术的使用。

根据欧洲最高法院2018年早些时候的判决,基因编辑作物应遵守与传统转基因生物相同的严格法规,这对包括许多科学家在内的支持者来说是一个重大挫折。

随着CRISPR技术的进一步进步和评估体系的建立,更多的国家可能愿意对CRISPR编辑作物持乐观和包容态度。

作为研究人员,除了进一步研究CRISPR技术以确保最大效益,同时最大限度地降低风险外,我们还需要关注公众的接受度。


返回首页


参考文献

CRISPR technology is revolutionizing the improvement of tomato and other fruit crops

Tian Wang, Hongyan Zhang & Hongliang Zhu


技术与服务
会员登录
登录
我的资料
我的收藏
购物车
0
留言
回到顶部