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糖尿病伤口微生物群的菌株和物种水平变化与临床结果和疗效相关

作者:Elizabeth A. Grice

慢性、非愈合性伤口是糖尿病的主要并发症,在美国每年医疗费用估计高达91-13亿美元。

微生物定植、生物膜形成和感染会损害DFU的愈合,并导致严重并发症,如骨髓炎和截肢。伤口感染被认为是高达90%截肢的基本原因。虽然微生物感染和关键定植被认为会损害愈合,并导致截肢等严重后果,但抗菌治疗无效,微生物在组织修复、再生和愈合中的作用仍不清楚。

在一项对100名非感染性神经性糖尿病足溃疡(DFU)患者进行的纵向前瞻性队列研究中,我们进行了宏基因组鸟枪法测序,以阐明菌株水平分辨率下的微生物时间动态,研究DFU微生物组的致病性和毒性,并确定其结果,治疗干预对DFU微生物群的影响。

缓慢愈合的DFU与生物膜形成、宿主入侵和毒力的特征相关。

虽然抗生素耐药性在基因水平上广泛存在,但清创术而非抗生素治疗显著改变了预后较好的患者的DFU微生物群。

金黄色葡萄球菌、条纹状葡萄球菌和粪大肠杆菌的主要临床分离株在角质细胞和糖尿病伤口愈合的小鼠模型中诱导差异生物学反应,

金黄色葡萄球菌菌株与非愈合伤口相关,引起最严重的表型。

总之,这些发现表明,伤口病原体金黄色葡萄球菌在慢性伤口结果中的应变水平多样化,

同时揭示了皮肤共生体和其他先前未被重视的伤口微生物群成分的潜在贡献。


基于扩增子的非培养测序方法(例如细菌和真菌核糖体RNA基因测序)突显了细菌和真菌微生物群定植DFU的多种微生物和时间动态特性。

然而,对于伤口微生物群在患者结局、并发症和愈合中的作用,这些方法只能获得有限的观察能力。这类方法的一个主要局限是分类分辨率差,无法准确识别物种或菌株水平。

越来越多的证据表明,单个物种内遗传上不同的菌株具有重要的功能差异, 影响与其宿主的相互作用。

宏基因组鸟枪法测序是对样本中的大量微生物基因组进行的无目标测序,可以解决这一局限性,同时提供对DFU微生物群的功能和毒性的洞察。

尽管在技术和计算上对含有大量“污染”的人体组织和细胞的临床伤口标本进行分析具有挑战性,但鸟枪宏基因组学有潜力对伤口愈合受损的微生物基础进行前所未有的深入研究,同时揭示愈合和并发症的临床重要生物标志物。

基于这些原因,我们对DFU样本进行了鸟枪基因组测序,以确定菌株水平的多样性,并分析了DFU微生物群的基因组含量。

我们确定了DFU微生物群的特征,包括个别菌株和致病性/毒力因子,这些特征与较差的愈合和结果有关。

使用来自同一个DFU患者的培养临床分离株,我们发现先前标记为皮肤共生体、伤口病原体和环境污染物的微生物对宿主具有差异和菌株特异性作用,

在糖尿病伤口愈合的小鼠模型中,这些微生物影响人角蛋白细胞产生细胞因子和伤口闭合。

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研究队列和设计概述

我们招募了100名神经病变、足底DFU的受试者来研究伤口生物负荷与临床结果之间的关系。

所有入选受试者在出现感染时均无临床症状,且在2周以上无抗生素暴露。

通过Levine的拭子从DFU中获取标本,该拭子对深层组织液进行取样。

同时测量并记录临床因素,包括:血糖控制(总血糖;血红蛋白A1c、Hgba1c)、炎症(白细胞计数、白细胞计数、C反应蛋白、CRP)、缺血(踝臂指数、ABI、趾臂指数、TBPI)和伤口氧水平(伤口边缘经皮氧压)。

所有患者在T=0时第一次采集伤口标本后,立即进行积极的外科清创。

每两周采集一次标本,然后进行保守的干净清创和非抑菌性生理盐水清洗处理,直到伤口愈合,或导致截肢,或在26周随访期结束时依然无法愈合。

在过滤掉在第一个收集时间点(t=2周)之前愈合、因未知原因或其他感染(如呼吸道感染)而退出研究、或样本缺失的患者后,我们进行了鸟枪宏基因组测序,从46名患者的时间序列中获得195个重建的宏基因组。

46名受试者中有17名(37%)出现并发症,定义为:1)伤口恶化,2)骨髓炎发展,3)或截肢。

DFU宏基因组的多样性和组成与16S rRNA基因扩增数据的一致性。

在映射读取到多界参考数据库后,细菌读取占检测到的微生物读取的最大比例(96%),

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、条纹棒状杆菌和粪产碱杆菌分别是所有样本中检测到的最丰富的细菌种类。

我们评估了该队列先前报道的鸟枪宏基因组测序与16S rRNA基因测序的一致性。

以往对伤口微生物群的独立培养研究都使用了基于扩增子的测序方法,这与基于培养的生物负载测量结果不一致。

我们使用两个α多样性指标评估了鸟枪宏基因组和16S rRNA基因扩增子序列之间的一致性。

Shannon香农多样性是样本中物种丰富度和均匀度的一个度量,在我们的两个数据集之间是一致的(ρ=0.36;p≤0.0001)。

物种丰富度由每个样本检测到的属级操作分类单位(OTU丰富度;16S rRNA扩增子测序)或属(鸟枪宏基因组)的数量来衡量,也一致,ρ=0.22;p≤0.01。

数据集中最丰富的属按降序排列为:葡萄球菌(18.95%)、棒状杆菌(14.64%)、假单胞菌(9.37%)和链球菌(7.32%)。

这些属与16S rRNA基因扩增子数据一致。

鸟枪宏基因组学显示金黄色葡萄球菌是主要的葡萄球菌种类,主要由单个菌株,即7372金黄色葡萄球菌控制。

葡萄球菌种类较少,包括凝固酶阴性的佩滕科菲氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模拟葡萄球菌和卢格登尼氏葡萄球菌。

治疗干预对DFU菌群的影响

在没有明显临床感染(热、水肿、化脓性分泌物)的情况下,尽管不建议对DFU使用抗生素,

但在随访期间,仍有30%的队列患者(以及我们46例患者中的37%)还是因伤口相关并发症或其他疾病接受了系统性抗生素治疗。


我们采用鸟枪宏基因组测序法对DFU患者的时间序列标本进行了菌株水平分类。

这使我们能够从匹配的病人来源的样本中进行特定微生物菌株的引导分离和全基因组测序。

尽管越来越多的文献致力于伤口微生物群的研究,但迄今为止的所有研究都只使用了基于扩增子的系统发育标记基因测序,如16S rRNA基因,无法区分单个物种。例如,葡萄球菌属中有皮肤共生体和臭名昭著的金黄色葡萄球菌。临床上将金黄色葡萄球菌视为与共生表皮葡萄球菌不同;

因此,它们的分类对于确定有效的治疗策略至关重要。此外,鸟枪宏基因组学允许应变水平跟踪和功能注释,这两个都揭示了DFU微生物群的新方面及其与本研究临床结果的关系。

通过测量α多样性的变化,我们进一步研究了在社区层面使用抗生素的效果。

我们确定抗生素不会改变愈合或未愈合伤口的整体多样性,提示对伤口内的微生物群几乎没有干扰。

我们的研究结果为临床显性感染保留使用抗生素的指导方针提供了进一步的支持,并表明使用抗生素不会对伤口愈合的总体目标产生积极影响。

为了确定能够区分对清创反应积极的伤口的微生物群特征,我们利用香农多样性评估了清创前后社区结构的全球变化。

伤口愈合后的微生物群(定义为清创后12周内完全再上皮化)表现出明显的多样性下降,这是由于整个社区厌氧菌数量减少所致。

血流量降低会导致局部组织缺血,从而促进厌氧微生物的生长。

我们得出结论,在整个DFU中,有多种厌氧细菌与混合好氧生物有关,我们的数据进一步表明,成功的清创是破坏厌氧网络的同时进行的。

因此,我们建议,在清创时,微生物组可作为愈合轨迹的预测标记,以靶向干膜细胞,而不降低清创后微生物组的多样性,以便进行更广泛的治疗。

考虑到棒状杆菌是我们队列中第二个最丰富的属,根据16S rRNA基因测序和鸟枪宏基因组分析,与先前的慢性伤口微生物组研究相一致。

我们发现,标准的临床微生物学方案在没有使用专门的工作流程的情况下,不会常规地对棒状杆菌进行分类,而是将有氧革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性的杆菌归为类白喉杆菌,并将其视为皮肤污染物。

在这项研究中,分离物首先通过生化试验被鉴定为棒状杆菌,直到分子鉴定证实它属于短杆菌属。

在伤口愈合的早期阶段,用粪便生物膜治疗糖尿病伤口的速度加快。这些发现提示了一些微生物在组织修复中的有益作用。

未来的研究应探讨粪链球菌、纹状体和其他“非致病性”伤口微生物群在多微生物环境中如何影响伤口病原体的毒力、宿主反应和愈合结果。

糖尿病伤口始终被金黄色葡萄球菌定植,因此我们将分析重点放在皮肤病原体上,以分类与不同伤口愈合结果相关的菌株。

我们鉴定了宿主范围广泛的金黄色葡萄球菌菌株和与未愈合伤口相关的菌株。

与伤口愈合不良相关的金黄色葡萄球菌基因组中含有多种抗生素抵抗基因和编码葡萄球菌肠毒素的基因。

这些超抗原通过对大量T细胞的非特异性刺激导致炎症反应加剧,表明这些菌株的定殖导致持续炎症,导致受损的愈合进程。

相反,对金黄色葡萄球菌分离株进行的基因组分析表明,这些菌株是免疫逃避的专家,因此有必要进行额外的研究,

将基因组多样性与发病机制的表型差异联系起来。

随着全球糖尿病和肥胖率的增加,慢性创伤(如DFU)的经济和社会负担预计将雪球增加。

因此,迫切需要新的管理和治疗方法。在这里,我们将鸟枪宏基因组测序应用于一种常见类型的慢性伤口,以确定与临床结果相关的微生物分类和遗传标记。通过将宏基因组和基因组分析与宿主反应和伤口修复的体外和体内模型相结合,我们证明了a)伤口病原体金黄色葡萄球菌的应变水平变化和b)通常被忽视的分离物(如皮肤共生体)的功能含义。

我们的研究结果表明,诊断和预后标志物的新靶点可指导治疗,并有可能实施以微生物为基础的靶点治疗,以改善愈合和临床结果。


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参考文献

Strain- and Species-Level Variation in the Microbiome of Diabetic Wounds Is Associated with Clinical Outcomes and Therapeutic Efficacy

Lindsay R. Kalan,Jacquelyn S. Meisel,Michael A. Loesche,Aayushi Uberoi,Sue E. Gardner,Elizabeth A. Grice


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