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单细胞RNA测序揭示药物诱导的干细胞背叛

来源:nature作者:N. Gopalakrishna Iyer & Ramanuj DasGupta

肿瘤是一种由遗传和表型多样化状态的细胞构成的复杂生态系统。

化疗耐药是癌症死亡的主要原因之一。我们使用单细胞转录组学来研究肿瘤细胞的不同化疗耐药模式。

肿瘤是克隆的,它们在选择压力下不断进化,这个观点是Peter Nowell在1970年首次提出的。

自那时以来,肿瘤内异质性(ITH)在各种遗传和表型水平都有记录。ITH在癌细胞群体中的驱动多样性允许肿瘤容纳具有肿瘤启动、耐药和转移特性的特殊细胞。

已有耐药细胞的选择和富集已被证明是耐药性最常见的驱动因素之一。然而,用特异细胞阵列来维持多克隆肿瘤可能非常昂贵,并且ITH的程度在各个患者肿瘤之间可能差别很大。

因此,不显示高程度ITH的表型均一群体如何能够逃避药物治疗和转移的选择压力,是一个重要的问题。

我们假设均质性肿瘤可以调用其他机制,如细胞重编程以获得新的表型状态,从而产生表型变异。

因此,细胞可塑性可以为均匀的肿瘤群体提供在药物治疗的冲击下生存所必需的选择性优势,从而促进耐药性。

值得注意的是,在没有任何选择压力的情况下,细胞重编程的潜力可能仍然被掩饰;只有在应用化疗药物的选择压力和/或转移时才会揭示出来。


肿瘤干细胞(CSC)已被证明具有耐药性。这种细胞在治疗应激下的选择是克隆选择的经典例子。

另一方面,去分化(其中分化的细胞改变其转录程序,以显示干细胞或祖细胞样性质),或转分化、或“细胞重编程”(谱系不忠的过程)已被建议来驱动适应性进化。

细胞重编程已经与谱系定义的启动子/增强子的表观遗传可塑性相关联。这种可塑性为导致细胞状态转变的基因调节程序的随机或确定性(由谱系定义的先驱因素引导)激活提供了框架。

因此,可以推断,在其他表型相同的亚稳细胞中,转录可塑性可以允许出现新的细胞类型。

我们假设,在选择压力下,随机或分子协调的表观遗传重编程,可能在表型均匀的细胞群体内获得不同的新细胞状态(细胞重编程)中,发挥重要作用。


在本研究中,我们通过研究表型均质和非均质肿瘤在抗癌药物的选择压力下采用的生存策略和转移来探索这一假说。

我们采用患者来源的原发性口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞系,来模拟肿瘤的演变及其对CSC群体的影响,同时在类似的选择压力下,在临床中进行回顾性和前瞻性验证。


OSCC是典型的侵袭性鳞状细胞癌(SCC),5年生存率为40-50%。OSCCs患者一般用顺铂辅助治疗。

我们使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)来研究顺铂选择压力下,肿瘤演化和转移扩散四个不同阶段的转录动力学。

利用这种方法,我们能够识别初治肿瘤细胞中,具有先前存在的耐药性和转移相关转录特征的罕见的CSC群体。

令人惊讶的是,在缺乏先前存在的表型异质性的情况下,我们发现,应激诱导的转分化是耐药和转移的主要驱动因素。

我们证明了先驱因子在确定不同的干细胞状态、暗示细胞异质性及其在驱动抗性和转移表型中的功能。

值得注意的是,表观基因组的时间和功能研究,让我们深入了解,在感知应对细胞压力的时候,这些干细胞因子和染色质重塑物(CR)之间相互作用。

总之,我们证明了预先存在的ITH导致CSC细胞在选择压力下的选择。另一方面,压力诱导的转分化,促使均质肿瘤细胞群体的适应性让由共价表观基因组先前确定的表型状态收敛。

20181123A1.jpg图1


结果

药物诱导的新生细胞状态

化疗耐药仍然是肿瘤复发的主要原因。

我们试图利用SCC的特定表型谱系标记物来研究细胞毒性处理对调节细胞状态的影响。

为此,我们分析了上皮(E-cadherin;ECAD)和间充质(Vimentin;VIM)在肿瘤组织中的表达特征,

这些特征是从初次治疗和匹配的口腔鳞状细胞癌(OSCC;n=20)患者局部复发的样本中获得的。这个队列只包括那些在治疗后出现局部复发的患者,包括使用基于顺铂的化疗。

表达分析表明,大多数肿瘤,20个中的16个;占80%,通过选择现有克隆产生耐药性,这通过保留的ECAD+上皮细胞或VIM+间充质样细胞状态来证明(补充图1a)。

相反,20例患者中有4例(20%)表现出药物诱导的可塑性,因为他们通过新生VIM表达细胞产生耐药性,从而导致出现间充质样细胞状态(补充图1b)。

我们假设,为了在药物治疗的选择压力下存活,肿瘤细胞群可以

(a)从由显性ITH产生的表型异质亚群的集合中选择预先存在的耐药细胞,

(b)采用新的耐药细胞状态/表型,利用细胞可塑性/重编程作为一种适应机制。

为了进一步探讨两种耐药模式的机制,我们从我们广泛表征的PDPC模型组中特异地选择了两种原发性OSCC患者衍生细胞系,HN120Pri和HN137Pri。

这些患者来源的细胞代表了理想的模型,其中HN137显示了上皮(ECAD+)和间充质(VIM +)群体的混合(图1A),而HN120系由ECAD+细胞的表型均一群体组成(图1B)。

此后,两个群体在顺铂治疗下进行选择,随后基于图像,每两周分析ECAD和VIM表达,直到抗性出现。大约有100个单细胞接种在384孔板的每个孔中,并用抗癌药物顺铂治疗(图1a,b)。

每个实验条件重复24次,以评估现象的可重复性。

这种设置允许我们测试两个主要结果:

(i)如果抗性细胞从选择中出现的频率大于1:100,那么在每个复制孔中都会观察到抗性克隆;否则,我们希望看到抗性克隆只出现在24个孔的子集中;

(i i)随机过程可能导致孔间不同的表型,而确定性过程将导致表现出相似细胞状态/表型的抗性克隆的出现和富集。

在顺铂治疗的前两周内,异质性HN137Pri细胞显示ECAD+富集,VIM+细胞逐渐减少(图1a)。

6周后,VIM+细胞被清除,同时选择稳定、均匀的ECAD+细胞群。这代表了显性介导的克隆选择的经典例子。

令人惊讶的是,对于以明显均匀的ECAD+群体开始的HN120Pri模型,我们在顺铂治疗两周内观察到VIM+细胞的新生(图1b)。

值得注意的是,大多数VIM+细胞还共同表达上皮(ECAD)标记,从而提示药物诱导的细胞状态转变。

这些观察表明,存在药物诱导的适应的隐性机制,这种机制仅在细胞经历选择压力时才表型地被揭示。

连续顺铂处理HN120Pri细胞,形成了以VIM主的群体(图1b)。

最引人注目的是,对HN137中已存在克隆的选择、HN120中由细胞可塑性介导的新细胞状态的出现,在所有24个实验条件下,均观察到,这表明这是一个确定性过程。

接下来,为了确定是否存在任何罕见的(<1:106细胞)预先存在的可影响耐药表型的耐药细胞,我们用顺铂处理1×107g个HN120Pri和HN137Pri细胞4个月,以产生耐药株HN120PCR、HN120MCR、HN137PCR和HN137MCR。这导致了与先前观察到的相似的表型结果,证实了HN120Pri中缺乏克隆选择,

并暗示了存在能够驱动细胞状态转变和表型变异的隐性机制的可能性(图1c,d)。


20181123B1.jpg

图2

我们观察到,程度较高的表型肿瘤内异质性(ITH)倾向于选择预先存在的耐药细胞,而表型均一的细胞在药物选择下,采用隐蔽的表观遗传机制来转分化。

这种适应性是由共价准备抗性染色质上的H3K27ac标记的选择性诱导增益驱动的,因此在初治环境中不表达。

对这一现象的审视表明,药物诱导的适应是随着干细胞因子SOX2的丧失和随之而来的SOX9的增长而获得的。

我们惊人地观察到SOX9在药物诱导的H3K27ac位点的富集,表明肿瘤的进化可能是由干细胞开关介导的表观遗传可塑性驱动。

重要的是,JQ1介导的BRD4抑制可逆转药物诱导的适应。这些结果提供了对治疗诱导的细胞可塑性模式的观察,并强调了表观遗传抑制剂在靶向肿瘤进化中的应用。


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参考文献


Longitudinal single-cell RNA sequencing of patient-derived primary cells reveals drug-induced infidelity in stem cell hierarchy

Ankur Sharma, Elaine Yiqun Cao, Vibhor Kumar, Xiaoqian Zhang, Hui Sun Leong, Angeline Mei Lin Wong, Neeraja Ramakrishnan, Muhammad Hakimullah, Hui Min Vivian Teo, Fui Teen Chong, Shumei Chia, Matan Thangavelu Thangavelu, Xue Lin Kwang, Ruta Gupta, Jonathan R. Clark, Giridharan Periyasamy, N. Gopalakrishna Iyer & Ramanuj DasGupta


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