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载体构建

载体构建主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。

载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。

一般步骤:

1. 通过PCR扩增目的基因片段

  PCR要设计引物,设计引物时要选择合适的同源序列,根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点,PCR的产物要纯化。

2. 酶切

  根据引物设计的酶切位点,分别对PCR产物和质粒载体进行酶切,酶切后的产物也要进行回收

3. 连接

  通过连接酶将酶切后的PCR产物和质粒载体进行连接

4. 转化

  将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a),涂板,培养过夜

5. 挑取单克隆,并鉴定

  挑去平板上的单克隆培养,可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序


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文章分类: 载体
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