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什么是sBioID邻近蛋白标记技术?

构建全面的蛋白质相互作用图谱是理解细胞功能的关键。一个特别的挑战是建立图谱不仅考虑到直接的二元蛋白质-蛋白质相互作用,而且还包括间接相互作用的信息(例如,在不直接相互作用的蛋白质之间,但它们都是同一多蛋白复合物的组成部分),以及邻近蛋白质网络。蛋白质相互作用的发现方法还需要考虑许多细胞过程中的动态性质,克服弱蛋白质-蛋白质相互作用带来的技术挑战。

利用修饰酶进行邻近依赖标记sBioID技术是一种新的蛋白质-蛋白质相互作用筛选方法,它解决了这些挑战。

一、Bio-ID技术原理

BioID技术利用大肠杆菌生物素连接酶BirA突变体BirA*的功能, 对空间上的临近蛋白进行生物素标记。

生物素连接酶是一种高度保守的、生物学上重要的酶,它利用生物素和ATP(三磷酸腺苷)生成一种高活性的生物素酰-5′-AMP(Bio-AMP)中间体。当BirA在R118G突变后,显著降低了对Bio-AMP的亲和力。提前释放的Bio-AMP与目标蛋白上的特定赖氨酸反应,在生物素和赖氨酸侧链之间形成酰胺键。通过亲和素纯化,然后用质谱, 鉴定生物素化蛋白。

这种生物素与邻近蛋白质共价标记反应,形成了BioID方法的基础。

在图中,靶蛋白(淡橙色)具有细长的结构,BirA*(红色)与N-末端融合(也可能是C-末端融合)。BirA*将外源添加的游离生物素转化为高活性但不稳定的生物素- 5’-AMP(黄色,Bio-AMP),它从酶的活性位点释放,无论它们是与融合蛋白相互作用(直接或间接通过额外的蛋白质-蛋白质相互作用),还是仅在近距离(标记半径10 nm,基于对NPC Y-复合体的研究,详情见正文),均可使其与近端蛋白(蓝色、绿色)上的赖氨酸γ-氨基反应。

远端蛋白质(灰色),不管它们是否与BirA*融合相互作用,都没有标记。在所示的例子中,当BirA*酶与相关的蛋白质的N-末端融合时,注意在蛋白质的C-末端相互作用的因子如何未被标记,因为它们位于有效标记半径之外。在生物素标记后,细胞在相对恶劣的条件下裂解并提取蛋白质。然后使用链霉亲和素纯化生物素化蛋白质(丢弃非生物素化蛋白质),并通过质谱鉴定。

但是早期的以BirA*为核心的BioID技术有严重的技术缺陷,一方面BirA*酶的生物素标记能力差,需要长时间(一般大于12小时)的标记,另外一方面BirA*含有DNA结合区域,因此非特异性背景高, 应用不广。虽然衍生的BioID2技术解决了DNA结合区域的问题,但生物素标记能力差和时间长的难题没有改善。我们的技术团队研发了新的sBioID技术, 根本解决了以往BioID的技术缺陷。

sBioID3SMALL.jpg

二、sBioID技术的特点与优势

sBioID技术可以在更加生理的状态下捕获与诱饵蛋白互作的蛋白种类或大分子复合体,摆脱一些传统蛋白互作研究方法中对高质量cDNA文库的依赖。此外,基于生物素和亲和素是自然界最强的非共价相互作用,因此可以使用更加苛刻的裂解液裂解细胞获得蛋白质,使用更加强烈的去垢剂洗涤样品,极大降低污染蛋白的干扰,提高信噪比和实验的可信性。


三、与其他研究蛋白相互作用比较

传统的蛋白质互作研究技术比如酵母双杂交(Yeast-two-hybrid)缺乏与哺乳动物细胞类似的翻译后修饰系统,而且依赖高质量的cDNA文库;免疫沉淀联合质谱分析(Immunoprecipitation-Mass spectrometry,MS)受限于抗体的质量,而且难于保存蛋白互作的空间定位信息,不能捕获较弱或瞬时的相互作用。

sBioID与传统的相互作用组发现方法相比, 具有显著的优势,特别是在识别短暂或微弱的相互作用方面,而且它也适用于不溶性亚细胞结构,已经对我们理解细胞结构和功能产生了重大影响。

1. 虽然生物素标记是邻近依赖的,它不需要sBioID融合体与要被生物素化的蛋白质之间有直接或间接的相互作用。虽然无相互作用,但邻近蛋白质也被标记,提供目标蛋白周围的蛋白质组景观的有用的信息。

2. 与sBioID融合体瞬时相互作用或瞬时接近的蛋白质也将被生物素化,并且至关重要的是,即使在相互作用停止或蛋白质已经从sBioID融合体附近离开之后,生物素化标记仍将保持。因此,sBioID非常适合于研究在空间和时间上都是动态的细胞过程。

3. 不同于更传统的方法,如亲和纯化,严格的提取条件会破坏蛋白质-蛋白质的相互作用,并导致数据丢失,在BioID细胞裂解和随后通过链霉亲和素结合分离生物素化蛋白质的过程中,可以在严格的条件下进行。

因此,sBioID被证明特别适用于研究不溶性蛋白质结构,如核体或中心体;而对sBioID的唯一要求是表达正确定位的sBioID融合蛋白。

四、应用范围

1. 普通蛋白质相互作用的筛选。

2. 蛋白质互作网络的构建。

3. 弱相互作用或瞬时相互作用的筛选(如寻找激酶的底物)。

4. 各种动物细胞筛选。


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