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技术简介

条件性基因敲除是通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或FLP-FRT来实现的。基因敲除把两个LoxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子两端,制备出Flox小鼠,该目的基因表达不受LoxP插入的影响,而当该Flox小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后,Cre酶的组织特异性表达可以促进目的基因两侧的LoxP位点发生重组,目的基因完整性被破坏,从而发生基因沉默,而该基因在其他组织或细胞表达正常。

应用

•可以制作胚胎致死型基因的基因敲除小鼠

•用于目的基因在特定组织或细胞中的功能性研究

•通过其他诱导系统控制Cre或Flp启动子的表达,还可以实现在时空上控制基因敲除的发生

制作原理

基因敲除是自80年代末发展起来的,利用小鼠胚胎干细胞的高重组效率将基因敲除或敲入的一种新型分子生物学技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DMA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。

制作流程

1. 打靶载体设计和构建(1-2个月)。

2. ES电转和单克隆分选(1-2个月)。

3. 阳性克隆鉴定(1个月)。

4. 8细胞或囊胚显微注射(2-3个月)。

5. 胚囊移植到假孕母鼠,获嵌合体或F0(2-3个月)。

6. 嵌合体与野生杂交得到F1代基因敲除小鼠(1周)。

制作小鼠流程1.jpg

检测评估方法

•载体鉴定:载体构建完成后,提供酶切及测序结果.

•判断转染是否成功:ES药物筛选及单克隆分选.

•判断载体片段是否整合:ES阳性克隆PCR及Southern Blot鉴定结果.

•判断核型是否正确:筛选获得的阳性克隆ES钿胞扩大培养后,每步都必须做核型检测,

显微注射时才能获得生殖系转移的嵌合体.

•判断杂合子小鼠基因型:剪鼠尾巴提DNA做PCR检测及测序分析。

四倍体互补法直接制作F0转基因小鼠

制作小鼠流程3.jpg

BAC重组技术的ESCs打靶和8-细胞胚胎显微注射技术获取F0条件性敲除小鼠



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