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CRISPR GUARD用短gRNA保护脱靶位点

作者:Taylor来源:nature

尽管脱靶是一个重要的安全问题,使用CRISPR-Cas9进行精确的基因组编辑任然是遗传疾病有希望的治疗方法。使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的主要限制是发生脱靶变异。

长度短于16个核苷酸的gRNA有效地将Cas9募集到基因组中的互补位点,但不让Cas9核酸酶激活。

在这里,我们描述了一种新的方法,CRISPR gRNA辅助减少损伤(CRISPR GUARD),一种旨在通过与无活性Cas9复合物竞争来阻断错配gRNA与脱靶位点结合的方法。这种方法通过协同递送短的gRNA,靶向脱靶位点,与着靶的gRNA竞争,来保护脱靶位点。

无活性复合物由Cas9与短gRNA或者GUARD RNA结合生成,与脱靶位点完全互补;

长度短于16个核苷酸nt的gRNA可以指导Cas9结合,但不支持核酸酶激活。

该方法可适用于使用催化失活的Cas9(dCas9),相关的RNA引导的核酸酶,碱基编辑器或其他序列特异性DNA结合蛋白,以形成占据脱靶基因座的惰性复合物,使其难以接近(图。1)。

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CRISPR GUARD可减少脱靶诱变,同时利用Cas9和碱基编辑器,保持靶向编辑的效率。

然而,如果短的向导RNA在脱氨酶激活窗口期内含有胞嘧啶,它们也可以支持碱基编辑。

我们通过体外研究和高通量筛选,探索设计规则和该方法的普遍性,揭示CRISPR-GUARD是一种快速实施的策略,可提高大多数基因组位点的基因组编辑特异性。

我们对比了完全互补的15nt GUARD RNA与固定DNA脱靶模板的错配gRNA的结合动力学, 来检测CRISPR GUARD方法。

利用生物膜层干涉技术BLI检测对比显示,催化活性不活泼的Cas9复合物与GUARD RNA或错配gRNA结合,用GUARD RNA时结合速度降低了29 ± 4%,表明在脱靶位点的竞争是可行的。

为了测试CRISPR GUARD保护DNA的可能性,我们选择了一系列潜在的GUARD RNA设计用于体外Cas9 DNA切割实验。

我们考虑了14nt或15nt的 GUARD RNA长度,或仅具有15nt靶向互补性的全长20nt设计。

GUARD RNA被设计为竞争性分子,着靶gRNA的截短形式,但掺入在脱靶位点发现的错配。

我们又设计了近端GUARD RNA,其结合脱靶位点的侧翼区域,预计降低的序列同源性将减少靶位点上的竞争,但仍然阻断了原型间隔区和原型间隔区相邻基序PAM。

我们将这些设计分别称为竞争性和非竞争性GUARD RNA。

首先,我们确定GUARD RNA不能使用短纯化DNA靶点、通过体外靶向和脱靶切割来控制核酸酶活性。

当与Cas9单独复合时,没有GUARD RNA操控DNA切割。

与VEGFA gRNA复合的Cas9显示出对着靶和脱靶CAVIN4 DNA的强力切割。

然而,添加非竞争性GUARD RNA未能保护脱靶位点。

仅使用15-nt竞争性GUARD RNA观察到显著的保护作用,但着靶切割也受到影响,表明两个位点的竞争。

当存在非常少的错配时,或者当gRNA的错配不能掺入截短的GUARD RNA设计中时,与着靶gRNA的竞争可能特别相关。


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参考文献

CRISPR GUARD protects off-target sites from Cas9 nuclease activity using short guide RNAsMatthew A. Coelho, Etienne De Braekeleer, Mike Firth, Michal Bista, Sebastian Lukasiak, Maria Emanuela Cuomo & Benjamin J. M. Taylor

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