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基于type I-F CRISPR-Cas系统的高效转录激活工具

作者:Yuxi Chen来源:Nature

根据cas基因排列和效应子复合物亚基的不同,CRISPR-cas系统被分为两类(Class 1和Class 2)和6个型号(I-VI型)。

Class 2 CRISPR–Cas系统,使用单一效应蛋白(例如Cas9,Cas12或Cas13),分为Type II (Cas9), Type V (Cas12), 和Type VI (Cas13),用于外源DNA或RNA干扰,是目前研究的最好的系统。

在过去的几年中,Class 2 CRISPR-Cas系统彻底改变了基础研究和临床研究,使培养的细胞和动物能够进行更快速,精确和稳健的基因组编辑和修饰。

Class 1 I类CRISPR-Cas约占所有CRISPR-Cas系统的60%。而Class 1 CRISPR-Cas(I型,III型和IV型)系统的应用则不多。只有I–B和I–E型系统已用于控制哺乳动物基因表达和基因组编辑。

近日,中山大学生命科学院的科学家团队首次把type I-F CRSIPR-Cas系统Cascade复合物的Csy3亚基与VPR(VP64-p65-Rta)融合, 可以高效激活哺乳动物细胞内源基因的表达。

该研究成果发表在Nature Communications上,题目为Repurposing Type I-F CRISPR-Cas System as a Transcriptional Activation Tool in Human Cells。

在这项研究中,研究人员证明了使用I–F型系统调节人类基因表达的可行性。通过将转录激活域与铜绿假单胞菌I–F Cas蛋白融合,可以激活人细胞中的基因转录。

在大多数情况下,I–F型系统比其他基于CRISPR的系统更有效。通过延长crRNA可以增强转录活性。

Class I CRISPR-Cas系统在细菌和古细菌中最普遍,约占60%,而Class 2仅占所有CRISPR-Cas系统约10%。

与Class 2CRISPR-Cas系统不同,Class 1 typeI型系统依赖Cascade进行DNA结合,进一步募集Cas3降解外源DNA。

与广泛使用的Class 2 CRISPR-Cas系统相比,Class 1 type I型CRISPR-Cas系统具有不同的特性,例如,用Cas3进行基因组编辑可以大片段敲除,在不同Cas蛋白-效应融合策略中产生多亚基。Class 1和Class 2 CRISPR-Cas系统之间的这些差异, 让Class 1 CRISPR-Cas系统在某些应用中有优势。

根据最近的分类研究,I型CRISPR-Cas系统有七种亚型(I–A至I–G)。

近年来,I-A、I-B、I-E和I-F CRISPR-Cas已被用于islandicus(I-A)、巴氏梭菌(I-B)、卷曲乳杆菌(I-E)、运动发酵单胞菌(I-F)和铜绿假单胞菌(I-F)的原核基因工程。

因此,开发基于I型CRISPR-Cas系统的工具可能会为基因组编辑和基因调控提供替代手段。

I–F CRISPR–Cas系统是经过充分研究的CRISPR–Cas系统之一。它比I–E CRISPR–Cas型系统(4对5)具有更少的Cascade,这将更容易控制和交付。

在这项研究中,研究人员探索了在哺乳动物细胞中开发可编程的I-F型和I-Fv型CRISPR转录激活工具的可能性。与I-E型和I-B型相比,I-F型铜绿假单胞菌和I-Fv型腐败舍瓦氏菌系统需要较少的亚单位用于细菌中的dsDNA靶向。此外,当基因调节剂融合到不同的亚单位时,I-F型和I-Fv型中的多个亚单位可能提供不同的标记组合,并增加信号强度。

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通过将VPR转录激活域融合到I-F型级联亚基Csy3,在HEK293T细胞中实现了外源性和内源性基因激活。

有趣的是,通过改变crRNA的间隔长度,可以提高靶基因的激活水平。与Class2类系统一样,可以通过从单个载体定制CRISPR阵列来实现多重基因激活。

此外,I-F型CRISPR-Cas系统专门激活靶基因而无需脱靶转录激活,可以在不改变任何预测的非靶基因表达的情况下,特异性地激活靶基因。这些数据证明了I–F CRISPR–Cas在人类细胞中的鲁棒性和可编程性,对基因组编辑具有重要意义。

广州美格生物的科学家团队参与了该项研究。

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参考文献

Repurposing type I–F CRISPR–Cas system as a transcriptional activation tool in human cells

Yuxi Chen, Jiaqi Liu, Shengyao Zhi, Qi Zheng, Wenbin Ma, Junjiu Huang, Yizhi Liu, Dan Liu, Puping Liang & Zhou Songyang


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